| Start | Informacje | Spis treści | Skomentuj | Słownik | Przydatne adresy | Liczba odwiedzin: 326164 |

6.4 Sprzęt do prowadzenia kultur zawiesinowych

6.5 Ocena jakościowa i ilościowa kultur zawiesinowych

Przez pierwsze dwa - trzy tygodnie prowadzona jest hodowla wstępna. W tym okresie należy ze szczególną uwagą sprawdzać czy hodowla nie brunatnieje (co może być spowodowane utlenianiem komórkowych fenoli, a powstające toksyczne związki powodują zamieranie hodowli) i czy nie pojawia się mleczne zmętnienie, co może być oznaką zakażenia.

Wszystkie manipulacje w hodowlach komórkowych muszą być przeprowadzane ze szczególną starannością ze względu na dużą podatność zawiesiny na zakażenia, spowodowaną następującymi czynnikami:

Zakażenie może objawiać się zmętnieniem pożywki (głównie w przypadku bakterii) lub - w przypadku pleśni - pojawieniem się watowatych strzępek. Zakażone hodowle można jednoznacznie rozpoznać posiewając niewielkie ich ilości na podłoża mikrobiologiczne. W niektórych przypadkach udaje się uratować zakażoną hodowlę dodając do niej odpowiedni antybiotyk lub fungicyd. Najczęściej jednak zakażone hodowle muszą być po prostu usunięte.

Do dalszej hodowli pobiera się możliwie jednorodną zawiesinę, oddzielając ją od resztek eksplantatu przez sączenie przez jałowe sitka. Pasaże prowadzone są zwykle co jeden do dwóch czy trzech tygodni. Podczas pierwszych pasaży stosuje się niewielkie rozcieńczenia inoculum (do 4 x). W okresie późniejszym, kiedy otrzymamy tzw. ustaloną zawiesinę, charakteryzującą się intensywnym i powtarzalnym w kolejnych pasażach przyrostem komórek, stosujemy rozcieńczenia ok. dziesięciokrotne.

W ocenie stanu zawiesiny pierwszorzędne znaczenie ma określenie szybkości namnażania komórek i ich zagęszczenia. W tym celu można po prostu policzyć komórki w próbce zawiesiny, wykorzystując do tego mikroskop i hemocytometr (szkiełko mikroskopowe z naniesioną siatką linii, przeznaczone głównie do liczenia krwinek). Zastosowanie hemocytometru jest nieco utrudnione przez fakt, że komórki roślinne są na ogół znacznie większe od krwinek, a poza tym jak już wspomniano, mogą tworzyć wielokomórkowe agregaty. W celu możliwie dokładnego policzenia komórek agregaty należy rozbić. Częściowo można to uzyskać pompując zawiesinę wielokrotnie pipetą lub strzykawką. W przypadku większych i bardziej spoistych agregatów konieczna może być maceracja chemiczna przy pomocy kwasu chromowego (20%) lub solnego (1 - 5 M) z ogrzewaniem na łaźni wodnej (60°C, 30 min) trójchlorooctowego (50%, w temp. pokojowej, do 30 min) lub enzymatycznie przy pomocy pektynazy i celulazy (37°C, kilka godzin). W podanych warunkach zwykle nie uzyskuje się całkowitego rozpadu agregatów, ale w drobnych skupiskach złożonych z kilku komórek można je już łatwo policzyć. Ze względu na to, że oznaczanie liczby komórek jest czynnością praco- i czasochłonną, coraz częściej stosuje się parametr uproszczony w postaci liczby jednostek (UN) na 1 cm3, a za jednostkę przyjmuje się zarówno pojedyncze komórki jak i agregaty. Jest to jednak wskaźnik mniej dokładny i wymaga ustalenia średniej liczby komórek na jednostkę. O liczbie komórek w zawiesinie można też wnioskować na podstawie parametrów pomocniczych, takich jak:

  1. świeża masa; zawiesina sączona jest przez filtr, który został wcześniej zważony, albo poddawana wirowaniu w zważonej wcześniej probówce wirowniczej; czasami dodatkowo oznacza się zawartość białka w masie komórek lub objętości hodowli
  2. sucha masa - komórki suszy się do stałej masy w temp. 70 - 120°C
  3. całkowita objętość komórek (ang. packed cell volume; PCV) - określoną objętość zawiesiny, na przykład 10 ml, wiruje się delikatnie w kalibrowanych porbówkach (300 g x 5 min), a następnie odczytuje objętość jaką zajmują komórki (zwykle wyrażając ją w % objętości zawiesiny)
  4. objętość komórek po sedymentacji (ang. sedimented cell volume; SCV) - kolby z hodowlami odstawiane są na krótki czas (np. 15 minut) w bezruchu, lekko pochylone (60°), a potem odczytana jest na odpowiedniej skali objętość osadu (wyraża się ją zwykle w % objętości zawiesiny).

Do liczenia komórek w zawiesinie można także wykorzystać urządzenia automatyczne, takie jak licznik Coultera i cytometr przepływowy. Licznik Coultera stosowany jest głównie w analizach hematologicznych, a jego wykorzystanie w biotechnologii roślin opisywano dość sporadycznie. Urządzenie wykrywa zmiany oporu elektrycznego pomiędzy dwiema elektrodami omywanymi strumieniem słabego elektrolitu, w którym zawieszone są zliczane komórki. Pojawienie się komórki pomiędzy elektrodami powoduje chwilowy wzrost oporu. Takie elektryczne impulsy zliczane są przez komputer. Urządzenie pozwala nie tylko na oznaczanie liczby komórek, ale także ich objętości (wzrost oporu jest tym większy im większa jest objętość komórki).

Znacznie częściej wykorzystuje się do liczenia komórek cytometrię przepływową. Technika ta opiera się na pomiarach fluorescencji komórek lub ich składników wybarwionych odpowiednimi znacznikami - fluorochromami. Praktycznie każda technika cytochemiczna oparta na pomiarach fluorescencji może być zastosowana do cytometrii przepływowej. Metoda pozwala na zliczanie pojedynczych komórek lub ich składników przepływających w laminarnym (niezaburzonym) strumieniu cieczy nośnej. Odległość, na której przeprowadzany jest pomiar, pojedyncza komórka pokonuje w ciągu 1 do 50 mikrosekund, w zależności od budowy aparatu. Impulsy odbiera odpowiedni detektor (lub fotodetektory) i przekazuje sygnał do elektronicznych układów analizujących. W ciągu sekundy urządzenie może wykryć ponad tysiąc komórek. Cytometria przepływowa bywa stosowana także do oznaczania zawartości DNA w komórkach (a na tej podstawie stopnia ich ploidalności). Poza urządzeniami typowo analitycznymi, istnieją również cytometry przepływowe sortujące, które pozwalają na szybkie segregowanie komórek zależnie od ich zdolności do barwienia się różnymi fluorochromami (krople cieczy nośnej zawierające komórki otrzymują ładunek elektryczny, dobrany zależnie od ich fluorescencji i w ten sposób kierowane są do jednego z kilku naczyń odbiorczych).

Dzięki ułatwionemu pobieraniu składników odżywczych, w kulturach zawiesinowych podziały komórek następują z dużą szybkością i przyrosty biomasy są większe niż na pożywkach agarowych. W hodowli okresowej wyraźnie zwiększające się zagęszczenie komórek prowadzi do stopniowych zmian warunków hodowli - zmniejsza się dostępność składników pokarmowych, a nagromadzają się metabolity uwalniane przez komórki. Zmiany te znajdują odbicie w częstości podziałów komórek, która wykazuje wyraźną okresowość. Odkładając na osi odciętych czas, a na osi rzędnych zagęszczenie komórek lub powiązane z nim parametry pomocnicze (mierzone zwykle co 2-3 dni) otrzymujemy krzywą wzrostu.

Krzywa wzrostu zawiesiny komórek w hodowli okresowej
Rys. 6.1 Krzywa wzrostu zawiesiny komórek w hodowli okresowej

W przebiegu typowej krzywej wzrostu zawiesiny hodowanej w systemie okresowym wyróżnić można 5 faz:

  1. spoczynkową - przyrost liczby komórek jest minimalny ze względu na efekt silnego rozcieńczenia inoculum świeżą pożywką; przygotowanie do podziałów
  2. wykładniczą - częstość podziałów wyraźnie wzrasta, zagęszczenie komórek jest jeszcze niewielkie, ale szybko się zwiększa; przyrosty liczby komórek na jednostkę czasu są coraz większe
  3. liniową - częstośc podziałów jest w przybliżeniu stała, a liczba komórek wzrasta w jednostajnym tempie - liniowo
  4. obniżonego tempa wzrostu - liczba komórek zbliża się do maksimum, a częstość podziałów zaczyna się obniżać
  5. stacjonarną - liczba komórek utrzymuje się na stałym poziomie lub spada, podziały komórek ustają.
Liczebność populacji komórek
pokolenia, czas ->0123456789101112131415161718
wzrost liniowy
wzrost wykładn.
wzrost sigmoidalny
faza stacjonarna
1000
1000
1000

1700
1700
1700

2400
2890
2890

3100
4913
4913

3800
8352
8352

4500
14199
14199

5200
24138
24199

5900
41034
34199

6600
69758
44199

7300
118588
54199

8000
201599
64199

8700
342719
74199

9400
582622
84199

10100
990458
94199

10800
1683778
101400

11500
2862423
104199
104199
12200
4866119
104199
104199
12900
8272403
104199
104199
13600
14063084
104199
104199

Na podstawie krzywej wzrostu określa się czas podwojenia populacji (ang. doubling time; DT; zwykle wynosi od kilku godzin do kilku dni), jak również ustala najodpowiedniejszy moment do przeszczepienia (pasażowania) zawiesiny lub pobrania próbek do doświadczeń, np. zawiesinę komórek tytoniu linii BY-2 przeszczepia się co 7 dni (co pozwala na utrzymanie dużego tempa podziałów przy ograniczeniu liczby pasaży), a do doświadczeń dotyczących reakcji komórek na stres pobiera się materiał już z 5-6 dniowych hodowli (co zapewnia możliwie najlepszy stan fizjologiczny wyjściowego materiału). Ogólnie zaleca się zwykle pasażowanie zawiesiny pod koniec fazy obniżonego tempa wzrostu lub na samym początku fazy stacjonarnej. Czasami oznacza się średni czas generacji - okres między kolejnymi podziałami komórek; wymaga to jednak użycia hodowli komórek dzielących się synchronicznie i zastosowania metod izotopowych, stąd nie jest to analiza przeprowadzana rutynowo.

Przy mniejszej gęstości wyjściowej zawiesiny i większym rozcieńczeniu inoculum faza spoczynkowa wydłuża się. Nie wszystkie wskaźniki wzrostu zawiesiny dają identyczny obraz zmian. Największy przyrost objętości i świeżej masy komórek może następować w fazie stacjonarnej, kiedy liczba komórek przestaje wzrastać.

Poza szybkością wzrostu zawiesiny interesująca jest także cytofizjologiczna charakterystyka komórek w hodowli, która może być oparta na wyznaczeniu następujących parametrów:

Zwiększeniu jednorodności hodowli służy frakcjonowanie komórek. W najprostszej wersji pasażuje się zawiesinę, pobierając najwyższą jej warstwę, po tym jak przez kilka minut była pozostawiona w bezruchu i najcięższe agregaty opadły na dno. Precyzyjniejsze jest sączenie zawiesin przez metalowe lub plastikowe, sterylne sitka o dokładnie znanej wielkości oczek, albo ultrawirowanie różnicowe (w gradiencie sacharozy albo Percolu). Frakcjonowanie komórek pozwala osiągnąć częściową ich synchronizację co do fazy cyklu komórkowego. Pełniejszą synchronizację osiąga się przez okresowe głodzenie hodowli, powodujące, że wszystkie komórki dochodzą do pewnego etapu cyklu komórkowego i pozostają w tej fazie, ponieważ nie są w stanie przejść do następnego etapu cyklu bez brakującego im składnika pożywki. Potem ponownie wprowadza się tę substancje do pożywki, albo przenosi komórki do świeżej pożywki i wszystkie komórki, które tylko na tę okazję czekały przystępują do następnego etapu cyklu mitotycznego. Opisywano synchronizowanie komórek przez głodzenie ich pod względem auksyn, cytokinin, jonów fosforanowych albo azotu. Na przykład brak 2,4-D w pożywce utrzymywał komórki tytoniu i marchwi w fazie G1. Inną metodą synchronizacji jest użycie inhibitorów syntezy DNA, takich jak 5-aminouracyl, tymidyna (w dużym stężeniu), hydroksymocznik. Po pewnym okresie działania inhibitora, komórki są zebrane (sączenie lub wirowanie), przepłukane świeżą pożywką i zawieszone w takiej pożywce (oczywiście już bez inhibitora). Powoduje to, że wiele komórek jednocześnie wkracza w fazę S cyklu mitotycznego.

Zawiesina komórek tytoniu (linii BY-2) barwiona błękitem Evansa
Ryc. 6.3 Zawiesina komórek tytoniu (linii BY-2) barwiona błękitem Evansa.
Zauważ, że tę zawiesinę tworzą drobne agregaty złożone z kilku komórek;
w dolnej części fotografii widać silnie chłonące barwnik komórki martwe lub uszkodzone

Komórki tytoniu (linii BY-2) obserwowane w mikroskopie kontrastowo-fazowym
Ryc. 6.4 Komórki tytoniu (linii BY-2) obserwowane w mikroskopie kontrastowo-fazowym;
zwróć uwagę na widoczne w dolnej części fotografii jądra komórkowe i zbiegające się ku nim mostki cytoplazmatyczne,
po których odbywa się krążenie cytoplazmy

6.6 Mikrohodowle. Bibułowe tratwy, warstwy odżywcze, mikrokomory


Ostatnia modyfikacja strony: 2008-05-13 19:41