| Start | Informacje | Spis treści | Skomentuj | Słownik | Przydatne adresy | Liczba odwiedzin: 326149 |

2.1 Mikrorozmnażanie

2.2 Zaburzenia rozwojowe i zmienność roślin produkowanych in vitro

Można by oczekiwać, że rośliny produkowane in vitro, metodami mikrorozmnażania, stale będą zachowywać swoje genetyczne właściwości i nie pojawią się wśród nich żadne osobniki nietypowe, ponieważ jak już wspominaliśmy, metody te opierają się na wegetatywnym rozmnażaniu roślin, w dodatku prowadzonym w ściśle kontrolowanych warunkach. Nie działają więc w procesie mikrorozmnażania takie mechanizmy odpowiedzialne za zróżnicowanie genetyczne organizmów jak segregacja chromosomów i genów (towarzyszące mejozie – przemianie zapoczątkowującej gametofity) oraz losowy - mniej lub bardziej - dobór osobników rodzicielskich i tworzonych przez nie gamet (zachodzący na etapie zapylenia i podczas zapłodnienia, zapoczątkowującego sporofit).

Mimo to, rośliny otrzymywane in vitro, a zwłaszcza regenerowane na drodze pośredniej organogenezy lub pośredniej somatycznej embriogenezy, wykazują często wyraźne zróżnicowanie, a cechy które się na to zróżnicowanie składają mogą być stosunkowo trwałe, w niektórych przypadkach nawet dziedziczne. Zmienność jaką czasami obserwujemy wśród roślin otrzymywanych metodą klonowania z komórek czy organów wegetatywnych (somatycznych) nazywamy zmiennością somaklonalną. Zbiór (klon) organizmów otrzymanych na drodze rozmnażania wegetatywnego i wykazujących jakąś charakterystyczną wspólną cechę, która pojawiła się nagle jako objaw zmienności somaklonalnej, nazywamy somaklonem. Mówiąc dokładniej, zmienność somaklonalna to pojawianie się różnic pomiędzy organizmami otrzymanymi w wyniku klonowania z somatycznych komórek lub tkanek tego samego organizmu oraz pojawianie się różnic pomiędzy produktami klonowania, a organizmem wyjściowym w tym procesie (pierwowzorem; materiałem matecznym).

Tak to przynajmniej wynika z praktyki stosowania terminu zmienność somaklonalna, jakkolwiek jest tu trochę terminologicznego zamieszania, wynikającego pewnie stąd, że nasz kochany szumiąco-świszcząco-trzaskający język dość kategorycznie odróżnia następujące pojęcia słabo odróżnialne w języku angielskim:

  1. zmienność (jako niestałość czasową, ogólną zdolność lub skłonność do ulegania zmianom)
  2. zróżnicowanie (aktualne, faktyczne występowanie różnic) oraz
  3. różnicowanie się (proces powstawania różnic). W języku angielskim oba pojęcia z powyższych punktów b) i c) „obsługuje” to samo słowo variation, występujące właśnie w terminie somaclonal variation; natomiast w znaczeniu z powyższego punktu a) używa się raczej innego wyrazu (variability). Można by się więc zastanawiać czy po polsku nie lepiej byłoby mówić o występowaniu lub braku zróżnicowania somaklonalnego raczej niż somaklonalnej zmienności; niemniej właśnie termin zmienność somaklonalna wszedł już do powszechnego użytku. Podobne zresztą definicyjne rozterki mogą sprawiać takie fachowe terminy jak zmienność genetyczna czy środowiskowa (por. http://pl.wikipedia.org/wiki/Zmienność).

Uważa się, że u podłoża zmienności somaklonalnej mogą leżeć trzy rodzaje przyczyn:

  1. mutacje (czyli zmiany sekwencji lub ilości DNA) zachodzące w komórkach hodowanych in vitro
  2. zachodzące w hodowli in vitro modyfikacje epigenetyczne – bardziej subtelne zmiany DNA, do pewnego stopnia odwracalne, polegające na metylacji lub demetylacji niektórych zasad azotowych (zwłaszcza cytozyny), zmianie stopnia zwinięcia (upakowania) jakiegoś odcinka DNA lub zmianie oddziaływań jakiegoś fragmentu DNA z białkami chromatyny
  3. niejednorodność genetyczna eksplantatu (zmienność in situ albo (=) in vivo), wywołana mutacjami lub modyfikacjami epigenetycznymi zaistniałymi jeszcze w tkankach rośliny rosnącej ex vitro, zanim pobrano eksplantat do założenia hodowli in vitro.

Jeśli oczekujemy, że metody rozmnażania wegetatywnego dostarczą osobników identycznych, to opieramy się na założeniu, że różne komórki wegetatywne tego samego organizmu są pod względem genetycznym identyczne: wszak pośrednio są potomstwem tej samej komórki – zygoty, powstałym w wyniku wielu podziałów mitotycznych. Okazuje się jednak, że u organizmów wielokomórkowych mitoza nie zawsze zachodzi jednakowo precyzyjnie i starannie. U roślin bardzo dokładnie kontrolowane są podziały mitotyczne w tkankach merystemów wierzchołkowych pędu i korzenia. Poza merystemami, komórki które zaczynają się różnicować, również mogą się dzielić, ale z mniejszą częstością i precyzją. Zdarza się u nich zwłaszcza rozprzężenie podziału komórkowego i replikacji DNA, a także zaburzenia w tworzeniu wrzeciona kariokinetycznego. Dochodzi do tego, że niektóre komórki somatyczne organizmu w zasadzie diploidalnego mają zwiększony stopień ploidalności. Taka niejednorodność tkanek zaznacza się wyraźnie zwłaszcza u niektórych gatunków, nazywanych roślinami polisomatycznymi. Ich przykładami są groch i rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana – modelowy obiekt badań w genetyce roślin). U rzodkiewnika stopień ploidalności dochodzi do 2n = 15x (kwindekaploid). W tkankach somatycznych, zwłaszcza u gatunków polisomatycznych występować mogą obok siebie komórki różniące się stopniem ploidalności (liczbą podstawowych genomów). Takie niejednorodne genetycznie (a właściwie kariotypowo) tkanki nazywamy miksoploidalnymi. Za przykłady gatunków stosunkowo wiernie przekazujących informację genetyczną nawet w częściowo zróżnicowanych tkankach somatycznych uważa się natomiast marchew i słonecznika.

W komórkach wegetatywnych gatunków polisomatycznych tworzyć się mogą chromosomy czterochromatydowe (diplochromosomy) albo wielochromatydowe (chromosomy olbrzymie, zwane też politenicznymi); proces który do tego prowadzi nazywamy endoreduplikacją. Poliploidyzacja może też objawiać się zwiększeniem się liczby, a nie grubości chromosomów (podwojeniem chromosomów bez podziału jądra komórkowego) w procesie nazywanym endomitozą.

Zmiana stopnia ploidalności wpływa na ekspresję genów, a pośrednio na wielkość komórek i roślin (zazwyczaj komórki i rośliny poliploidalne są nieco większe w porównaniu z diploidami czy tym bardziej haploidami). Poza zmianą stopnia ploidalności w genomie komórek somatycznych mogą zachodzić rekombinacje – zmiany wzajemnego układu odcinków DNA. Może to być spowodowane uaktywnieniem się (przemieszczaniem się) ruchomych elementów genetycznych (transpozonów i retrotranspozonów), a także międzychromosomową wymianą wzajemną, czyli „przekrzyżowaniem się” chromosomów homologicznych, albo mówiąc już całkiem fachowo - crossing-over. Oczywiście proces ten jest w zasadzie charakterystyczny dla mejozy, ale sporadycznie zdarza się także podczas mitoz w komórkach somatycznych.

Nic więc dziwnego, że rośliny regenerowane z różnych komórek tkanki genetycznie niejednorodnej mogą różnić się nieco wielkością, wyglądem i innymi właściwościami. Istotę zmienności somaklonalnej przedstawia poniższy rysunek, oczywiście w ujęciu wybitnie humorystycznym.

zmienność somaklonalna

Zupełnie poważnie jednak można liczyć się z tym, że pojawią się na przykład następujące fenotypowe efekty zmienności somaklonalnej:
zmiana wrażliwości rośliny na chorobę (zwiększenie się lub obniżenie wrażliwości), zmiana szybkości wzrostu lub pokroju rośliny (np. intensywność rozgałęziania się, karłowatość), modyfikacja budowy organów (np. pojawianie się liści typu „ziemniaczanego” u pomidorów, zmiana wielkości płatków i zaburzenie symetrii kwiatów – badane m.in. u storczyków), męska sterylność, zmiana szybkości dojrzewania owoców.

Interesujące, że autorzy, którzy wprowadzili termin „zmienność somaklonalna” – Larkin i Scowcroft11 – zaobserwowali najpierw właśnie nagłe pojawienie się cechy korzystnej – niespodziewane uodpornienie się roślin (trzciny cukrowej) na fitopatogena (Helminthosporium sacchari). Rozmnażali in vitro rośliny wrażliwe, zamierzając je wykorzystać jako obiekt doświadczeń fitopatologicznych, których bardzo odległym efektem miało być otrzymanie roślin odpornych. Tymczasem rośliny takie pojawiły się jakby spontanicznie, w wyniku mutacji wywołanych samą hodowlą in vitro.

Bardzo charakterystycznymi objawami zmienności somaklonalnej są anergizacja i albinizm. Anergizacja, zwana też habituacją, albo przyzwyczajeniem się hodowli została opisana już w 1942 roku przez Gauthereta, a polega na tym, że tkanka (zwykle kalusowa), która początkowo do wzrostu wymagała jakiegoś składnika pożywki (zwykle fitohormonu, zwłaszcza cytokininy), po pewnym czasie się od niego uniezależnia, tak jakby przyzwyczaiła się, że pożywka zawsze tę substancję zawiera i w końcu „nie dostrzega”, że po kolejnym pasażu tej substancji w pożywce jednak nie zastosowano. Efekt ten tłumaczy się zwykle podwyższeniem tempa biosyntezy endogennych hormonów w tkance albo obniżeniem się zdolności komórek do unieczynniania endogennych fitohormonów, ewentualnie też zmianą wrażliwości komórek na określone fitohormony. Najnowsze badania wskazują zwłaszcza na znaczenie ostatniego z wymienionych wyżej czynników oraz epigenetyczny charakter tej zmiany.

Termin „anergizacja” stosowany jest też w nauce o odporności ludzi i zwierząt, ale oznacza tam unieczynnienie, zniesienie wrażliwości komórek odpornościowych na antygen (czy epitop). Z kolei słówko „habituacja” może oznaczać przywykanie czyli „jest zjawiskiem neurologicznym występującym w układzie nerwowym w przypadku wielokrotnego występowania tego samego bodźca. Odpowiedź układu na kolejne bodźce jest wówczas coraz mniejsza” (Wikipedia). Typowe rozumienie anergizacji czyli habituacji w roślinnej biotechnologii (zaniknięcie reakcji na niedobór czynnika wzrostowego) niewiele ma więc wspólnego ze znaczeniem tego terminu w immunologii i neurologii (osłabienie reakcji na obecność jakiegoś czynnika). Z drugiej strony zdarzają się i prace, w których autorzy mówią o habituacji jako przywykaniu komórek roślinnych do herbicydu, a wtedy słowo to używane jest zgodnie z jego ogólniej przyjętym znaczeniem. Również i tak rozumiana habituacja może być przejawem zmienności somaklonalnej.

Albinizm natomiast polega na całkowitym lub częściowym zaniku zdolności tkanek asymilacyjnych do wytwarzania chlorofilu, co prowadzi do powstawania pędów białych lub żółtawych.

Jak widać z powyższego zestawienia, zmienność somaklonalna w niektórych przypadkach może mieć swój aspekt pozytywny, gdy prowadzi do pojawienia się roślin o nowych korzystnych właściwościach (efektowny wygląd, krzaczasty, bujny pokrój, mniejsze wymagania co do składu pożywki, wzrost odporności na choroby). Rzeczywiście próbuje się czasem wykorzystać zmienność somaklonalną do doskonalenia odmian roślin, podobnie jak wykorzystuje się do tego mutagenezę indukowaną przez czynniki chemiczne lub fizyczne. Jednakże w pracach nad mikrorozmnażaniem, tj. „masowym kopiowaniem” roślin, zmienność somaklonalna jest zjawiskiem raczej niepożądanym (wszak dobra kopia powinna być wierna pierwowzorowi). Również w pracach nad otrzymywaniem organizmów genetycznie zmodyfikowanych (transgenicznych) zmienność somaklonalna budzi obawę – jaki może być skutek transformacji genetycznej w połączeniu z losową zmiennością somaklonalną? Niełatwo to przewidzieć, a trzeba dokonać próby takiej prognozy by ocenić zagrożenia związane z planowaną manipulacją.

Wymienione wyżej uwarunkowania zmienności somaklonalnej nie różnią się bardzo swą istotą – zarówno w przypadku mutacji, jak i modyfikacji epigenetycznych chodzi o zaburzenia w działaniu DNA. Mutacje i modyfikacje epigenetyczne różnią się skalą zaburzeń - mutacje to pojawianie się nowej treści w informacji genetycznej (choćby w formie powtórzenia istniejących już wcześniej fragmentów albo pominięcia części informacji genetycznej), zaś modyfikacje epigenetyczne to zmiana łatwości odczytywania pewnych obszarów DNA. Dział genetyki ogólnej obejmujący badania mechanizmów kształtowania się zmienności epigenetycznej nazywamy epigenetyką (ang. epigenetics).

Różnego rodzaju zaburzenia w budowie DNA są naturalnym elementem działania organizmów; pozorna niedoskonałość aparatu replikacji i naprawy DNA pozwala na pojawianie się w naturze coraz to nowych genów i genotypów i stanowi ważną siłę napędową ewolucji. Choć zaburzenia takie zdarzają się sporadycznie w warunkach zupełnie naturalnych, ich częstość może znacznie wzrosnąć pod wpływem stresów. W warunkach hodowli in vitro komórki narażone są na pewien stres (nie są to w końcu warunki dla nich typowe). Ten stres może z jednej strony pobudzać somatyczną embriogenezę (a więc może odgrywać rolę pozytywną w regeneracji roślin), przyczynia się jednak także do wyraźnego wzrostu częstości mutacji.

Czy więc mutacje indukowane przez promieniowanie jonizujące albo mutageny chemiczne nie różnią się niczym od mutacji będących składnikami zmienności somaklonalnej? Okazuje się, że między zmiennością somaklonalną, a „zwykłą” zmiennością mutacyjną mogą jednak istnieć pewne różnice (a badacze spierają się jeszcze na ile istotne są te różnice). Czasami obserwowano pojawianie się cech w wyniku zmienności somaklonalnej, których nie udawało się wcześniej uzyskać na zasadzie indukowanej mutagenezy. Tak było na przykład z genami gametofitowej niezgodności (S) u pomidora, decydującymi o oddziaływaniach pomiędzy pyłkiem a słupkiem u różnych form tej rośliny, z zasady obcopylnej. Badając niezbyt wielką liczbę skomaklonów wykryto formy o zmienionej charakterystyce sterylności warunkowanej przez geny S. Nie zdołano natomiast nigdy uzyskać takiego efektu przy pomocy typowych mutagenów. Stwierdzono ponadto, że wśród wariantów somaklonalnych stosunkowo często znajduje się osobniki wykazujące mutacje o charakterze dominującym. W wyniku zmienności somaklonalnej takie zmiany zachodzą około 10 razy rzadziej niż pojawianie sie mutacji recesywnych, ale to i tak bardzo często w porównaniu z częstością jedna mutacja dominująca na 100 mutacji ustępujących, obserwowaną w przypadku indukowanej mutagenezy. Ponadto przypuszcza się, że liczba mutantów homozygotycznych pod względem zmutowanego genu jest w przypadku zmienności somaklonalnej dziwnie wysoka. Wysunięto hipotezę, że przyczyną tego zjawiska jest mitotyczna rekombinacja (= somatyczny crossing over, czyli crossing over zachodzący w komórkach dzielących się mitotycznie).

O poziomie zmienności somaklonalnej decydują głównie następujące czynniki: gatunek + genotyp („tło genetyczne”), rodzaj eksplantatu, typ hodowli (np. u marchwi w hodowlach zawiesinowych obserwowano zmienność somaklonalną częściej niż na pożywkach agarowych), skład pożywki, całkowita długość okresu utrzymywania rośliny czy tkanki w hodowli in vitro i częstość pasażowania. Zmienność somaklonalna występuje zwłaszcza w przypadkach gdy rozmnażanie roślin poprzedzone jest powstawaniem kalusa (pośrednia organogeneza pędowa i pośrednia somatyczna embriogeneza). Zazwyczaj w wyniku zmienności somaklonalnej zdolności kalusa do regeneracji roślin stopniowo obniżają się. Zachodzeniu mutacji sprzyja obecność w pożywce indukcyjnej wysokich stężeń silnych, syntetycznych auksyn, a zwłaszcza 2,4-D. Na natężenie zmienności somaklonalnej wpływa także gatunek rośliny i jej genotyp.

Zaburzenia związane ze zmiennością somaklonalną są dosyć trwałe, losowe i nieprzewidywalne. Nikt nie potrafi z góry powiedzieć który spośród tysięcy genów zmutuje pod wpływem jakiegoś czynnika środowiskowego. Jeśli jednak już do określonej mutacji dojdzie, zostaje ona przekazana organizmom potomnym tworzonym w procesie rozmnażania generatywnego. Zmiany epigenetyczne z kolei raczej nie ulegają dziedziczeniu u potomków generatywnych (uważa się, że w procesie płciowego rozmnażania stan epigenetyczny komórek ulega jakby wyzerowaniu), ale mogą być przekazywane zupełnie wiernie potomkom powstającym na zasadzie rozmnażania wegetatywnego. Kolejne pokolenia takich roślin oznaczane są symbolami R1, R2 itd. (od „regenerant” = odtworzona roślina). Wyszukanie rośliny wyróżniającej się w wyniku zmienności somaklonalnej zapoczątkowuje pokolenie S1, a kolejne pokolenia roślin regenerowanych z tej formy wyjściowej oznaczane są jako S2, S3 itd.

W przypadku gdy eksplantat użyty do hodowli zawiera komórki generatywne, a nie tylko somatyczne, komórki te wykazują zwykle znaczną zmienność rekombinacyjną, związaną z działaniem czynników wymienionych na wstępie tego rozdziału. W takim razie rośliny otrzymywane z takich eksplantatów z zasady wręcz nie będą jednakowe. Na zmienność rekombinacyjną nałożyć się mogą jednak dodatkowe zaburzenia o charakterze mutacji lub modyfikacji epigenetycznych, podobnych do wspomnianych wyżej. Jeśli jednak zachodzą one w tkankach generatywnych, wywołaną przez nie zmienność nazywamy gametoklonalną.

Poza zaburzeniami dość nieprzewidywalnymi, losowymi, jakimi są mutacje i modyfikacje epigenetyczne, w kulturach in vitro zaznaczyć się mogą także inne nieprawidłowości, bardziej fizjologiczne niż genetyczne, nie ulegające dziedziczeniu i na ogół cofające się, gdy tylko zostaną ulepszone warunki hodowli. Takich nietrwałych, niedziedzicznych i nieprzypadkowych zmian nie zalicza się raczej do zmienności somaklonalnej (piszemy tak ostrożnie, bo terminologia dotycząca zmienności somaklonalnej i zjawisk pokrewnych nie jest jeszcze bardzo skrystalizowana). Wyróżnikiem takich zaburzeń fizjologicznych – o charakterze bardziej deterministycznym niż losowym - jest wysoka częstość ich występowania w danym typie hodowli (czasami obserwuje się je we wszystkich hodowlach prowadzonych na określonej pożywce i w danych warunkach).

Typowym przykładem tego typu zaburzeń jest witryfikacja (inaczej szklistość), czyli nadmierne uwodnienie tkanek roślinnych, stających się mniej lub bardziej przezroczystymi; szklistości często towarzyszy słaby rozwój blaszki liściowej, słabe wykształcenie miękiszu, tkanek przewodzących, kutykuli; niewielka liczba i nietypowe rozmieszczenie aparatów szparkowych, obniżona zawartość chlorofilu w liściach. Nieprawidłowościom w gospodarce wodnej i fotosyntezie u roślin hodowanych in vitro próbuje się czasem zaradzić ulepszając wentylację naczyń hodowlanych (powietrze przechodzi przez filtry mikrobiologiczne w pokrywkach tych naczyń), stabilizując poziom dwutlenku węgla np. przy pomocy roztworu KHCO3 i K2HCO3, obniżając temperaturę (lub zwiększając dobowe wahania temperatury), obniżając zawartość cytokinin w pożywce, dodając do pożywki soli wapnia (glukonian, chlorek lub azotan), testując różne stężenia i rodzaje cukru i agaru (lub innych czynników żelujących). Typowe zaburzenia fizjologiczne w rozwoju hodowanych in vitro roślin polegają także na zachwianiu korelacji wzrostowych, np. przeroście pędu lub korzenia, nieprawidłowej budowie zarodka (wieloliścieniowość, liścienie zrośnięte w rurkę itp). Dość częstym mankamentem fizjologicznym roślin regenerowanych in vitro jest słaby rozwój systemu korzeniowego, utrudniający oczywiście przeniesienie takich roślin do uprawy ex vitro.

Interesujące uzupełnienia (po angielsku):
http://www.ndsu.edu/pubweb/~mcclean/plsc431/chromnumber/number7.htm
http://www.agron.missouri.edu/mnl/68/105sachan.html
http://www.ucl.ac.uk/~ucbhdjm/courses/b242/ChromEvol/ChromEvol.html


1 Larkin P J & Scowcroft W R. Somaclonal variation—a novel source of variability from cell cultures for plant improvement. Theor. Appi. Genet. 60:197-214, 1981.
2.3. Krioprezerwacja i inne metody długotrwałego przechowywania materiału biologicznego


Ostatnia modyfikacja strony: 2010-11-28 16:50