| Start | Informacje | Spis treści | Skomentuj | Słownik | Przydatne adresy | Liczba odwiedzin: 312128 |

1.5 Rodowód hodowli roślinnych komórek, tkanek i organów

2.1 Mikrorozmnażanie

Mikrorozmnażanie, czyli rozmnażanie klonalne lub mikropropagacja, jest jednym z najważniejszych praktycznych zastosowań roślinnych czystych kultur. Termin ten oznacza wykorzystanie hodowli in vitro do masowego rozmnażania wegetatywnego roślin. Oczywiście cząstka "mikro-" w nazwie tej techniki odnosi się jedynie do ilości wyjściowego materiału biologicznego, natomiast liczba uzyskiwanych w ten sposób roślin potomnych może być bardzo wysoka. Poza wysokim współczynnikiem rozmnożenia (proporcją liczby uzyskanych roślin do wyjściowej liczby roślin użytych do rozmnażania) zaletą tej techniki jest bardzo duże wyrównanie genotypowe i fenotypowe produkowanych roślin, charakterystyczne zresztą dla wszystkich metod rozmnażania wegetatywnego. Wyrównaniu właściwości roślin sprzyja też fakt, że mikrorozmnażanie prowadzi się w dokładnie kontrolowanych warunkach laboratoryjnych. Ścisła izolacja hodowanego materiału od zewnętrznego środowiska, ułatwia otrzymanie roślin wolnych od patogenów i szkodników a także uniezależnia produkcję od miejscowych warunków geograficznych, klimatycznych itp. Z drugiej strony, praca w warunkach laboratoryjnych pociąga za sobą znaczne koszty produkcji, bo urządzenie laboratorium i jego eksploatacja są niewątpliwie wielokrotnie droższe w porównaniu z bardziej tradycyjnymi metodami produkcji roślin. W związku z tym technika ta wykorzystywana jest obecnie głównie w odniesieniu do roślin, których cena jednostkowa jest stosunkowo wysoka, na przykład roślin ozdobnych, drzew i krzewów owocowych lub leśnych, a także cennych materiałów hodowlanych i gatunków zagrożonych wyginięciem. Argumentem przemawiającym za wykorzystaniem tej techniki w produkcji sadzonek drzew leśnych jest fakt, że w odniesieniu do tych gatunków nie istnieją, albo mało skuteczne są prostsze metody rozmnażania wegetatywnego, natomiast kwitnienie i owocowanie tych roślin następuje dopiero gdy osiągną wiek kilkudziesięciu lat. Do mikrorozmnażania wystarczy pobrać niewielki fragment młodej siewki, gdy tylko stwierdzimy, że właśnie ta roślina wykazuje korzystne cechy fenotypowe. Ze względu na pracochłonnośc i wysokie koszty produkcji mikrorozmnażanie nie ma obecnie znaczenia w towarowym rolnictwie, bo przy masowości produkcji rolniczej cena pojedynczej rośliny musi być tu bardzo niska. Nawet jednak rośliny typowo rolnicze, np. ziemniak, bywają poddawane mikrorozmnażaniu, lecz nie przez rolników - producentów, ale hodowców. Dzięki temu z pojedynczych wyselekcjonowanych roślin można uzyskać zdrowy i wyrównany materiał mateczny, który potem dodatkowo powiela się metodami już bardziej tradycyjnymi i tańszymi.

Można wyróżnić następujące główne sposoby mikrorozmnażania:

  1. hodowle wierzchołków pędów; jest to forma wzrostu uorganizowanego - wierzchołki pędów rosną, ukorzeniają się, po czym zostają adaptowane do warunków ex vitro i wykorzystane jako sadzonki); odcinek pędu stosowany w tej metodzie ma zwykle długość od kilku milimetrów do kilku centymetrów i zawiera zarówno merystem wierzchołkowy jak i towarzyszące mu zawiązki liści; możliwe jest też regenerowanie roślin ze znacznie mniejszych eksplantatów (długości poniżej 1 mm), zawierających niemal wyłącznie tkankę merystematyczną; jednakże izolowanie merystemów, a nie wierzchołków pędów, będąc techniką dość pracochłonną, stosuje się w nieco innych celach niż mikrorozmnażanie i omówione jest dokładniej w dalszej części tego skryptu
  2. pobudzenie rozwoju pąków bocznych w hodowlach odcinków pędów to metoda bardziej uniwersalna i dużo częściej stosowana niż poprzednia; eksplantatami są węzły łodygi (odcinki z których wyrastają liście); u nasady liści występują uśpione pąki boczne (zwane też pachwinowymi), które w wyniku izolacji eksplantatu, a czasami także pod wpływem występujących w pożywce cytokinin, wznawiają wzrost i tworzą pędy, wykorzystywane następnie podobnie jak w poprzedniej metodzie; również ta metoda opiera się na zjawisku uorganizowanego wzrostu in vitro - komórki eksplantatu realizują program rozwojowy, który został im przypisany jeszcze w warunkach in vivo);
  3. pąki kątowe
  4. powstawanie pąków przybyszowych bezpośrednio w tkankach eksplantatu - o tej drodze regeneracji mówimy, gdy zawiązki pędów tworzą się w kulturze in vitro od nowa, w wyniku przeprogramowania komórek eksplantatu, tzn. eksplantat nie zawierał pąków; utworzyły się dopiero w kulturze in vitro; mamy tu więc do czynienia nie tylko ze wzrostem uorganizowanym, ale wcześniej jeszcze z organogenezą pędową (kaulogenezą); jeśli organogeneza nie jest poprzedzona powstaniem kalusa nazywamy ją bezpośrednią; poza kaulogenezą, drugą podstawową formą organogenezy jest ryzogeneza, czyli tworzenie się przybyszowych korzeni; o ile jednak z pędu zazwyczaj łatwo i szybko daje się odtworzyć pełną roślinę, to z korzenia udaje się to dosyć rzadko, dlatego ryzogeneza praktycznie nie bywa stosowana do mikrorozmnażania roślin
  5. powstawanie pąków przybyszowych z komórek kalusa - organogeneza pędowa pośrednia; zjawisko podobne do opisanego w poprzednim punkcie, ale w tym przypadku komórki eksplantatu najpierw odróżnicowują i namnażają się, wytwarzając kalus, a dopiero niektóre komórki kalusa przystępują do odtwarzania rośliny;
  6. powstawanie zarodków somatycznych bezpośrednio w tkankach eksplantatu - bezpośrednia somatyczna embriogeneza (to bardzo pożądany sposób rozmnażania roślin - odpada konieczność ukorzeniania pędów; zarodki tworzą się od razu, nie trzeba czekać na rozwój kalusa; zwykle jednak nie jest tak pięknie - częściej udaje się zastosować metodę poniższą)
  7. powstawanie zarodków somatycznych z komórek kalusa - somatyczna embriogeneza pośrednia (wadą tej metody jest obserwowana często niestabilność genetyczna komórek kalusa; zachodzą w nich spontanicznie zmiany, które powodują, że regenerowane w ten sposób rośliny nie są tak wyrównane jak można by oczekiwać po metodzie wegetatywnego rozmnażania).
  8. metody mikrorozmnażania

Przedstawiona tu terminologia nie jest całkiem powszechnie uznawana. Niektórzy badacze za mikrorozmnażanie uznają tylko techniki wymienione w punktach 1-2. W ujęciu nieco mniej rygorystycznym do mikrorozmnażania zalicza się wszystkie powyższe techniki, poza opartymi na somatycznej embriogenezie (p. 5, 6). Niemniej, na naszych zajęciach będziemy trzymać się powyższego schematu (podążając z grubsza za sugestią prof. Murashigego) i do mikrorozmnażania zaliczać będziemy wszystkie metody wymienione w punktach 1-6.

Wykorzystując wierzchołki pędów i pąki kątowe do mikrorozmnażania roślin nie oczekujemy od komórek eksplantatu jakiejś radykalnej zmiany zachowania, w stosunku do tego jakie wykazywały in planta, czyli w hodowanej ex vitro, nie uszkodzonej roślinie. Wprawdzie pąki kątowe w warunkach in vivo są zwykle uśpione, ale już sam fakt oddzielenia ich od wierzchołka łodygi wyzwala je spod wierzchołkowej dominacji (narzuconej przy pomocy auksyn transportowanych w dół łodygi) i pobudza ich rozwój. Dlatego do rozmnażania roślin przy pomocy wierzchołków pędów i pąków pachwinowych wystarczyć mogą pożywki nie zawierające żadnych fitohormonów. Z drugiej jednak strony, dodanie do pożywki fitohormonów, zwłaszcza cytokinin, przyspiesza przełamywanie dominacji wierzchołkowej, nasila rozgałęzianie się pędów i zwiększa współczynnik rozmnożenia. U niektórych gatunków od samej cytokininy korzystniej działa jej kombinacja z auksyną, pobudzającą wydłużanie się pędów. Również giberelina GA3 oraz kwas ferulowy mogą sprzyjać namnażaniu pędów i ich prawidłowej budowie (długości międzywęźli, wielkości liści).

Spośród auksyn, w mikrorozmnażaniu roślin opartym na hodowlach wierzchołków pędów i pąków kątowych, a także na organogenezie pędowej, najczęściej wykorzystuje się IAA, NAA lub IBA. 2,4-D natomiast okazuje się zwykle zbyt silną auksyną do tego celu i zamiast tworzenia się pędów pobudza wzrost kalusa (natomiast w metodach opartych na somatycznej embriogenezie, najczęściej wykorzystywaną auksyną jest właśnie 2,4-D, patrz niżej).

Dwie pierwsze z omawianych tu metod mikrorozmnażania nie różnią się istotnie od tradycyjnego rozmnażania roślin przy pomocy sadzonek wierzchołkowych i odkładów (jakkolwiek zadowalają się znacznie mniejszą ilością materiału wyjściowego). Wydaje się, że wszystkie gatunki rozmnażane tymi tradycyjnymi metodami nadają się też do rozmnażania in vitro za pomocą wierzchołków pędów lub pąków kątowych. Wśród roślin do rozmnażania których te metody rzeczywiście są wykorzystywane w produkcji na dużą skalę, można wymienić m. in. maliny, wiśnie, śliwy, jabłonie, winorośl, a także dalie, gerbery, storczyki, ziemniaki i wiele innych. U tych gatunków z jednego eksplantatu można w ciągu roku "wyprowadzić" tysiące roślin potomnych. Co kilka tygodni (zwykle co miesiąc) pędy odcinane są od tkanki macierzystej i pasażowane na świeżą pożywkę namnażającą.

Pędy ziemniaka, zwłaszcza gdy są hodowane na pożywce o niskim potencjale osmotycznym (zawartości sacharozy podwyższonej np. do 60 g/l), w niskiej temperaturze (ok. 10°C) i przy krótkim dniu (8 godzinnym) mogą tworzyć tzw. mikrobulwy, czyli bulwy o średnicy zaledwie kilku milimetrów. Tworzenie się mikrobulw nazywamy tuberyzacją in vitro (od ang. tuber - bulwa) i w pracach nad mikrorozmnażaniem roślin traktujemy zwykle jako proces pożądany. Dodatkowo można go pobudzić dodając do pożywki pochodną kwasu jasmonowego zwaną kwasem tuberonowym. Mikrobulwy, można wysiewać do gleby jak nasiona, a przy tym są znacznie wygodniejsze w manipulacji i odporniejsze na uszkodzenie niż młode sadzonki.

Organogeneza pędowa, bezpośrednia lub pośrednia, pozwala na uzyskanie jeszcze większego współczynnika rozmnożenia niż hodowle wierzchołków pędów czy pąków kątowych. Pod wpływem odpowiedniego zestawu fitohormonów, obejmującego w przypadku tej metody zazwyczaj zarówno cytokininę, jak i auksynę, niektóre komórki ekskplantatu lub namnożonego na nim kalusa wytwarzają zawiązki pędów - pąki. Czasami w obrębie jednego eksplantatu może się ich tworzyć kilkadziesiąt. Tak bywa na przykład u popularnych roślin ozdobnych z rodziny ostrojowatych, takich jak sępolia (Saintapaulia), syningia (Sinningia) czy skrętnik (Streptocarpus), u których łatwo jest pobudzić powstawanie pędów przybyszowych w niewielkich (kilkumilimetrowych) fragmentach blaszki liściowej i ogonków liściowych. Znamienne, że rośliny te łatwo, choć nie aż tak wydajnie, dają się rozmnażać z liści również w warunkach ex vitro. Rośliną bardzo wydajnie dającą się rozmnażać w ten sposób jest też tytoń, ale takich przykładów można znaleźć dużo więcej. Już pod koniec ubiegłego wieku szacowano, że lista roślin, dla których opublikowano metody mikrorozmnażania (którąkolwiek z powyższych metod) przekroczyła sześćset gatunków i obejmowała praktycznie wszystkie rośliny ważne gospodarczo. U roślin cebulowych, np. lilii, tulipanów, jako eksplantaty wykorzystuje się często kawałki liści spichrzowych, a wynikiem hodowli jest tworzenie się drobnych, kilkumilimetrowych cebulek - mikrocebul.

Wynik hodowli zależy od właściwości biologicznych rośliny, składu pożywki (a zwłaszcza rodzaju i stężeń fitohormonów) a także warunków hodowli. Za wzorcowe, "klasyczne", uważa się dziś badania wpływu auksyn i cytokinin na hodowle tkanek tytoniu, przeprowadzone przez Skooga. W doświadczeniach tych okazało się, że najszybsze tworzenie kalusa następowało przy umiarkowanych, niezbyt wysokich stężeniach auksyn i cytokinin. Zwiększenie zawartości auksyn sprzyjało tworzeniu się przybyszowych korzeni, a podwyższenie zawartości cytokinin pobudzało organogenezę pędową.

W procedurach mikrorozmnażania roślin w oparciu o wierzchołki pędów, pąki kątowe i organogenezę pędową wyróżnić można kilka typowych etapów (nie wszyscy autorzy wyodrębniają punkty pierwszy i ostatni; pozostałe natomiast etapy są na tyle jednoznacznie rozumiane, że producenci ogłaszają krótko np. "sprzedam rośliny po III etapie mikrorozmnażania"):

  1. Dobór materiału roślinnego
  2. Założenie czystej (aksenicznej) kultury
  3. Namnażanie pędów
  4. Przygotowanie pędów do wykorzystania w warunkach ex vitro
    1. wydłużanie
    2. ukorzenianie
    3. (ewentualne wstępne hartowanie)
  5. Przesadzenie roślin do gleby, hartowanie

Na etapach oznaczonych tu numerami 0 - 1 uwzględnia się wszystkie kryteria, o których wspominaliśmy przy omawianiu ogólnych zasad doboru eksplantatu (por. rozdz. 1), a ponadto zwraca się uwagę na te cechy biologiczne i użytkowe roślin matecznych, które odziedziczone przez rośliny potomne, będą wyznaczać ich wartość handlową (np. barwa i wielkość kwiatów, pokrój rośliny). W celu sprawdzenia skuteczności odkażania można niektóre eksplantaty umieścić na typowych podłożach mikrobiologicznych, które lepiej niż pożywki dla roślin pobudzają wzrost drobnoustrojów i pozwalają na szybsze ich wykrycie. Badanie obecności charakterystycznych drobnoustrojów w eksplantatach, albo nawet w roślinach matecznych, z których eksplantaty dopiero będą izolowane, nazywa się czasem z angielska indeksacją (ang. indexing for pathogens), zwłaszcza jeśli wykorzystuje się w nich pożywki różnicujące, metody biochemiczne, albo rośliny wskaźnikowe, dające bardzo charakterystyczne, silne reakcje na obecność jakiegoś drobnoustroju i pozwalające na jego identyfikację.

Na etapie namnażania otrzymuje się bardzo dużą liczbę drobnych (kilkumilimetrowych) zawiązków pędów. Przenosząc je na pożywkę zawierającą znacznie mniejsze stężenia regulatorów wzrostu, lub wcale nie zawierającą fitohormonów, zatrzymuje się proces namnażania pędów, a pobudza ich wzrost. Czasami na etapie wydłużania pędów wykorzystuje się pożywki zawierające węgiel aktywny, który pochłania pozostałości fitohormonów przenoszone wraz z materiałem roślinnym z poprzedniego etapu hodowli. Ukorzenianie pędu i jego wzrost mogą zachodzić na tej samej pożywce. W razie potrzeby ukorzenianie może być pobudzane przez dodatek niewielkiej ilości auksyny takiej jak IAA, IBA lub NAA.

Konieczność hartowania regenerowanych in vitro roślin wynika z dużej różnicy pomiędzy warunkami środowiska in vitro i ex vitro. Przede wszystkim chodzi tu wilgotność powietrza (w kulturach in vitro często bliską 100%) oraz obecność cukru i innych związków organicznych w pożywce, przy ich niemal zupełnym braku w glebie. Zabieg hartowania, a nawet ukorzeniania, może być przeprowadzony (a zwłaszcza kontynuowany) już po przesadzeniu roślin do gleby. Przez okres 1 - 2 tygodni utrzymywana jest wysoka wilgotność powietrza (rośliny mogą być osłonięte tunelami foliowymi) i dość niskie natężenie światła (zacienienie). Później stopniowo usuwa się osłony zmuszając rośliny do adaptowania się do warunków właściwej uprawy ex vitro.

Metodą mikrorozmnażania, która powinna dać się stosunkowo łatwo automatyzować, a więc okazać się stosunkowo mało pracochłonną, tanią, jest wykorzystanie somatycznych zarodków. Skoro mówimy o zarodkach somatycznych, to dla jasności sprawy uzgodnijmy od razu jakie w ogóle rodzaje roślinnych zarodków będziemy wyróżniać. Ogólnie dzieli się je na zygotyczne i niezygotyczne czyli apomiktyczne. Somatyczne należą oczywiście do tej drugiej grupy. Do zarodków apomiktycznych poza somatycznymi, zalicza się jeszcze zarodki partenogenetyczne, powstające z żeńskiego gametofitu, a zwłaszcza należącej do niego komórki jajowej i androgeniczne, powstające z mikrospory (niedojrzałego ziarna pyłku) lub męskiego gametofitu (kiełkującego ziarna pyłku). Wszystkimi zarodkami innymi niż somatyczne będziemy się zajmować w dalszej części tego podręcznika. Dodajmy, że czasami obserwujemy zarodki somatyczne wyrastające na powierzchni innych, starszych zarodków, somatycznych lub zygotycznych. Taki szczególny rodzaj zarodków somatycznych nazywamy przybyszowymi lub dodatkowymi.

Zarodki somatyczne i zygotyczne są oczywiście podobne nie tylko z nazwy, ale wykazują podobną budowę i podobne przemiany rozwojowe - pojedyncza komórka, drobne agregaty komórkowe, zarodek kulisty (globularny), sercowaty, torpedowaty (hodowcy roślin czasem mówią "stadium torpedo" bo torpeda to po angielsku właśnie torpedo) i stadium liścieniowe. W wyniku wzrostu, zarodki przekształcają się ostatecznie w rośliny. Wydaje się, że somatyczną embriogenezę (SE) można wywołać u wszystkich gatunków roślin, ale widoczne są duże różnice gatunkowe i genotypowe w zdolności do SE. Stosunkowo łatwo uzyskuje się to zjawisko np. u marchwi, kalafiora selera, rzepaku, cytryny, kawy, a z gatunków rolniczych - lucerny.

Somatyczną embriogenezę pobudzają warunki hodowli, a mianowicie obecność auksyny (zwłaszcza silnych, syntetycznych auksyn jak 2,4-D i pikloram), odpowiedni (wysoki) stosunek azotu amonowego do azotanowego, dość wysokie pH (ok. 7). W niektórych hodowlach indukująco może działać obecność określonych aminokwasów (zwłaszcza kwasu glutaminowego i proliny) lub kwasów organicznych. Również obecność cytokininy sprzyja zapoczątkowaniu SE, a szczególnie skuteczna pod tym względem bywa zeatyna. Działanie egzogennej auksyny konieczne jest tylko we wstępnej fazie somatycznej embriogenezy. Później (po okresie kilku dni do miesiąca) hodowle przenoszone są na pożywkę, która albo auksyny nie zawiera, albo zawiera jej dużo mniej niż pożywka indukująca (tę drugą pożywkę nazywamy różnicującą). Na pożywce indukującej powstają masy komórek prazarodkowych, tzw. PEMy (od ang. proembryogenic masses), które niewiele różnią się wyglądem od zwykłego kalusa i tworzą tzw. kalus embriogenny czyli zarodkotwórczy (po angielsku zarodkotwórczy to embryogenic, stąd w polskich tekstach pojawia się też czasem słowo "embriogeniczny", znaczące dokładnie to samo co embriogenny). Gdyby te skupiska komórek nie zostały następnie przeniesione na pożywkę różnicującą, to pozostałyby w formie embriogennego kalusa, powiększającego rozmiary, lecz nie tworzącego uorganizowanych struktur.

Tylko niektóre komórki eksplantatu reagują na działanie czynników indukujących SE. Komórki te nazywamy kompetentnymi. Inne w tych samych warunkach wytwarzają tylko kalus, czy zawiesinę, albo w ogóle nie reagują. Kompetentymi okazują się na ogół komórki epidermalne lub położone tuż pod nimi subepidermalne, a także komórki powierzchniowej strefy kalusa, lub hodowane pojedynczo komórki parenchymatyczne. Komórki embriogenne mają charakterystyczną budowę - zwykle są stosunkowo drobne, izodiametryczne, zawierają dużo cytoplazmy i duże jądro komórkowe, a wakuole - drobne , silnie barwiące się błękitem toluidyny, a więc zawierające dużo białka. W chloroplastach tych komórek można dostrzec ziarna skrobi, natomiast zanika gradient protonowy, co sugeruje, że fotosynteza ulega w nich zahamowaniu.

Somatyczna embriogeneza jest procesem bardzo wszechstronnie badanym, co wynika zarówno z jej znaczenia praktycznego, jak i poznawczego. W tym procesie wyjątkowo wyraźnie przejawia się rozwojowa elastyczność i totipotencja komórek. Podczas SE zachodzą podobne przemiany jak w rozwoju zarodków zygotycznych, ale są łatwiej dostępne obserwacji, bo nieukryte pod tkankami nasienia i owocu. Nagromadzające się stopniowo obserwacje sugerują, że SE może być ściśle powiązana z reakcjami roślinnych tkanek na różnorodne czynniki stresowe.

Działanie egzogennej auksyny polega prawdopodobnie na zakłóceniu metabolizmu auksyny endogennej i nagromadzaniu się w komórkach dużych ilości IAA. Poza omówionymi wyżej, dokładnie udokumentowanymi induktorami SE, jako czynniki pobudzające ten proces opisywano sporadycznie metale ciężkie i wysoką temperaturę, a także egzogenny kwas abscysynowy i betainę - substancje, które rośliny same wytwarzają, gdy znajdą się w warunkach stresu. Wytwarzane w embriogennych komórkach cząsteczki RNA kodują tzw. białka związane z patogenezą i białka szoku termicznego. Wśród białek intensywnie wydzielanych przez embriogenne komórki wykrywa się chitynazy, glukanazy i białka osmotynopodobne. Bardzo charakterystyczne dla komórek embriogennych jest powlekanie ścian komórkowych kalozą i nagromadzanie w ścianie komórkowej białek arabinogalaktanowych (AGP). Białka te zawierają glukozaminę i ich obecność wyjaśnia zapewne uaktywnianie się chitynaz podczas embriogenezy. Do niedawna zjawisko to było zupełnie niezrozumiałe, gdyż wydawało się, że w roślinach nie ma żadnego substratu dla tych enzymów. Okazuje się jednak, że białka AGP "nadtrawione" chitynazami wykazują zwiększoną zdolność do nadawania komórkom stanu kompetencji i indukowania SE. Dodając AGP do pożywki z kulturami, które po dłuższym okresie hodowli utraciły zdolność reagowania na typowe induktory SE, przywrócono tym kulturom kompetencję rozwojową. Poszukując markerów molekularnych SE, wykryto gen SERK, kodujący kinazę receptorową somatycznej embriogenezy (Somatic Embryogenesis Receptor Kinase). ). Jego uaktywnienie się jest najwcześniejszym znanym obecnie objawem nabycia przez komórki somatyczne zdolności (kompetencji) do rozwoju zarodkowego.

W niektórych doświadczeniach obserwowano, że pierwszy podział komórki embriogennej zachodzi w szczególny sposób, przypominający podział zygoty, a mianowicie jest niesymetryczny - jego wynikiem są dwie komórki różniące się wielkością. W rozwoju zarodków zygotycznych komórka mniejsza, określana jako wierzchołkowa, po kilku kolejnych podziałach przekształca się w zarodek właściwy, a komórka większa, zwana podstawową przekształca się w wieszadełko, twór ułatwiający odżywianie zarodka właściwego. Wieszadełko wraz z drobnym, mało jeszcze zróżnicowanym zarodkiem właściwym, nazywane jest łącznie prazarodkiem. Podobnie w somatycznej embriogenezie obserwuje się, jak wspomniano wyżej, komórki zwane prazarodkowymi, i powstające z nich odpowiedniki zarodka właściwego. Typowego wieszadełka w somatycznej embriogenezie nie daje się zwykle zaobserwować.

Zarodki somatyczne można masowo wytwarzać w płynnej pożywce, w specjalnych bioreaktorach (fermenterach). Otrzymane jednak w warunkach in vitro zarodki są zbyt delikatne, aby je po prostu wysiać do gleby, tak jak się to robi ze zwykłymi nasionami. Dlatego najpierw zarodki te poddawane są zabiegom przygotowawczym, np. łagodnemu suszeniu albo otoczkowaniu - umieszcza się je więc jakby w kapsułkach z substancji ochronnej, takiej jak alginian wapnia lub potasu, czy syntetyczne żywice (np. glikol polioksyetylenowy). Tak zabezpieczone zarodki somatyczne nazywane są sztucznymi nasionami, albo nasionami syntetycznymi, albo somatycznymi. Układem nieco prostszym od kapsułek z pojedycznymi zarodkami jest tzw. wysiew cieczowy (ang. fluid drilling), przy którym zarodki są po prostu zawieszone w pewnej objętości gęstej ochronnej cieczy i wraz z nią wylewane są do gleby.

Wyróżnia się więc kilka rodzajów sztucznych nasion:

  1. odwodnione nieotoczkowane
  2. odwodnione otoczkowane
  3. uwodnione otoczkowane (oczywiście ich znaczne uwodnienie nie jest zamierzonym wynikiem jakiegoś zabiegu technologicznego, ale efektem hodowli na pożywce zoptymalizowanej do szybkiego wzrostu kultury)
  4. uwodnione nie otoczkowane indywidualnie, ale stosowane w układzie siewu cieczowego.

Nasiona typu (c) i (d) są metabolicznie aktywne, a więc oddychają, zużywają tlen i złożone metabolity, a nagromadzają produkty oddychania; z tego powodu są nietrwałe i wkrótce po wytworzeniu powinny być wysiane do gleby. Natomiast nasiona typu (a) i (b) dają się długo przechowywać, bo w wyniku odwodnienia komórek ich metabolizm jest zahamowany, ale sam proces osuszania powoduje spadek żywotności wielu zarodków. Tak więc otrzymanie wysokiej jakości sztucznych nasion z zarodkami odwodnionymi jest trudne, gdy jednak ta sztuka się uda, nasiona takie można przechowywać stosunkowo długo. Czasami podobnym zabiegom ochronnym poddaje się inne niż zarodki fragmenty roślin, które wysiane do gleby mogą przekształcić się w kompletne rośliny. Mogą to być np. mikrobulwy, mikrocebule, pąki. Takie laboratoryjnie wytworzone "rozmnóżki" roślin można również nazwać sztucznymi nasionami. Uogólniając więc nieco, możemy przyjąć, że sztuczne nasiona to zarodki somatyczne lub inne drobne eksplantaty (mikrobulwy, mikrocebule, pąki) otrzymane in vitro i przygotowane do wysiania do gleby (zabezpieczone przed uszkodzeniami). To przygotowanie polega najczęściej na otoczkowaniu substancją zwiększającą mechaniczną wytrzymałość eksplantatów. Funkcje ochronne otoczki można wspomagać wysycając ją fungicydami, fitoncydami lub odpowiednio wybiórczymi herbicydami. Czasami rozważa się też dodawanie substancji zapasowych do otoczki, dzięki czemu pełniłaby nie tylko rolę okrywy nasiennej, ale także sztucznego bielma, odżywiającego zarodek podczas wzrostu. Wzrost w pełni wykształconego zarodka, wznowiony po przerwaniu spoczynku, nazywa się oczywiście kiełkowaniem. Tego terminu unika się jednak gdy mowa o somatycznych zarodkach i sztucznych nasionach, głównie dlatego, że nasiona te z reguły nie przechodzą spoczynku więc faza powstawania zarodka (wzrostu zarodkowego) i jego przekształcania się w siewkę (kiełkowania) nie dają się tu wyraźnie rozgraniczyć. Zamiast więc o kiełkowaniu sztucznych nasion mówi się zwykle o ich konwersji (ang. conversion) czyli przekształcaniu się w rośliny. Przekształcanie się zarodka somatycznego (lub sztucznego nasienia) w prawidłowo zbudowaną roślinę nazywamy konwersją. Częstość konwersji (w %) jest podstawowym wskaźnikiem jakości sztucznych nasion.

Próby przemysłowej produkcji sztucznych nasion zaczęto podejmować w 80-tych latach ubiegłego stulecia. Obecnie produkowane są m. in. sztuczne nasiona marchwi, selera, lucerny, papryki, winorośli, kalafiora, soi i ryżu. Mimo to do dziś wykorzystuje się je raczej sporadycznie. Jedną z najważniejszych przyczyn są wysokie koszty produkcji. Produkcja w warunkach sterylnych, na sztucznych pożywkach, nawet gdy prowadzona jest w wielkiej skali, w instalacjach przemysłowych, nie może konkurować pod względem ceny z pozyskiwaniem nasion zygotycznych metodami tradycyjnej uprawy polowej. Nie do końca zostały też rozwiązane problemy techniczne, dotyczące wydajności indukcji somatycznej embriogenezy i synchronizacji tego procesu, co jest warunkiem automatyzacji produkcji. Utrudnieniem jest nietrwałość sztucznych nasion (trudności w ich przechowywaniu) oraz niewystarczająca żywotność. Ważnym problemem jest też zróżnicowanie genetyczne roślin otrzymywanych ze sztucznych nasion. Właściwie należałoby oczekiwać, że zmienności takiej wcale nie będzie, ponieważ jak już wspominaliśmy, sztuczne nasiona można uznać za formę wegetatywnego rozmnażania roślin. Nie działają więc podczas ich powstawania takie mechanizmy odpowiedzialne za różnicowanie genetyczne jak segregacja genów (towarzysząca mejozie) i losowy dobór gamet (mający miejsce podczas zapłodnienia). Mimo to, rośliny otrzymywane z somatycznych zarodków czy sztucznych nasion, wykazują często wyraźne zróżnicowanie, i to również o podłożu genetycznym. Zjawisko to obserwuje się zresztą w mniejszym lub większym natężeniu także przy innych metodach mikrorozmnażania roślin.

2.2 Zaburzenia rozwojowe i zmienność roślin produkowanych in vitro


Ostatnia modyfikacja strony: 2010-10-14 21:20