| Start | Informacje | Spis treści | Skomentuj | Słownik | Przydatne adresy | Liczba odwiedzin: 307184 |

1.2 Pożywki

1.3 Odkażanie

W typowych kulturach in vitro panują warunki możliwie dokładnie kontrolowane. Hodowane rośliny wolne są od zakażeń, albo towarzyszy im tylko ściśle określony i celowo wprowadzony przez badacza rodzaj drobnoustrojów. Takie czyste, wolne od przypadkowych zakażeń kultury nazywamy aksenicznymi. Kultury in vitro powinny być akseniczne. Wymaga to odkażenia zarówno pożywki jak i materiału roślinnego używanego do założenia hodowli. Odkażaniu trzeba też poddać wszelkie narzędzia i naczynia z którymi eksplantaty mogą się stykać.

Najczęściej stosowaną metodą odkażania pożywek i wszelkiego rodzaju płynów (np. wody do płukania materiału roślinnego), a czasami także naczyń i narzędzi jest autoklawowanie. Zabieg ten polega na przetrzymywaniu materiału w parze wodnej o wysokiej temperaturze (zwykle ok. 120°C) i wysokim ciśnieniu (zwykle 1 atm, tj. 0,1 MPa, powyżej ciśnienia atmosferycznego). W wodnych roztworach przy podanym ciśnieniu zachodzi wrzenie w temperaturze 121°C, a więc jest to maksymalna temperatura do jakiej można doprowadzić te roztwory przy podanym ciśnieniu (oczywiście, w warunkach ciśnienia atmosferycznego nie dało by się ich podgrzać powyżej 100°C). Przyjmuje się, że w podanych warunkach w ciągu około 15 minut w autoklawowanym roztworze giną wszelkie drobnoustroje. Jednakże mija trochę czasu zanim cała objętość roztworu osiągnie zadaną temperaturę, stąd w praktyce czas autoklawowania wydłuża się, zależnie od objętości roztworu, do 20 - 30 minut (przy typowych objętościach, nie przekraczających 1 litra). Nie wszystkie substancje dają się podgrzać do 121°C - niektóre są zbyt nietrwałe i ulegają w takich warunkach rozkładowi. Jeśli pożywka zawiera takie wrażliwe składniki (zwane też termolabilnymi) to można odkazić je w niewielkiej objętości roztworu na zasadzie filtracji, a potem dodać do wyautoklawowanej i ochłodzonej pożywki. Stosuje się w tym celu filtry o porowatości poniżej 0,3 μm (zwykle 0,22 μm), które powinny zatrzymać wszelkie zarodniki grzybów i przetrwalniki bakterii. Same filtry, przed ich wykorzystaniem mogą być poddane autoklawowaniu, albo dostarczane są przez producenta gotowe do użycia, odkażone promieniami X lub gamma (promienie X, to promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali 10-11 - 10-9 m, natomiast promienie γ to fale elektromagnetyczne o długości poniżej 10-11 m). Typowymi związkami termowrażliwymi, wymagającymi odkażania przez filtrację, są np. GA3, zeatyna, ABA, mocznik, niektóre witaminy. W pewnym stopniu termolabilna jest też sacharoza, która w wysokiej temperaturze częściowo rozpada się na fruktozę i glukozę. Podczas długotrwałego autoklawowania może dochodzić także do karmelizacji - powstają brunatne aldehydy, takie jak furfural, metylofurfural, metyloglioksal. Działają one niekorzystnie na wzrost tkanek, dlatego niektórzy autorzy zalecają żeby roztwory sacharozy odkażać przez filtrację (choć w praktyce, przy typowej, niezbyt wysokiej zawartości sacharozy w pożywce, bardzo rzadko się tego przestrzega).

Metalowe narzędzia, takie jak skalpele pincety, igły preparacyjne mogą być odkażane przez autoklawowanie, albo w roztworze podchlorynu sodu (podobnie jak materiał biologiczny - patrz niżej), najczęściej jednak odkaża się je przez zanurzenie w alkoholu (denaturacie), a następnie opalenie nad palnikiem gazowym albo w specjalnym elektrycznym sterylizatorze. W odniesieniu do termoodpornych pustych naczyń i narzędzi można też zastosować tzw. suchą sterylizację, polegającą na przetrzymaniu ich w wysokiej temperaturze w suchym powietrzu (co najmniej 3 godz. w 160°C, albo 2 godz. w 170°C, albo pół godz. w 180°C).

Do powierzchniowego odkażania materiału biologicznego (części roślin) wykorzystuje się substancje uwalniające chlor (podchloryn sodowy, podchloryn wapnia, chloraminę) lub tlen (wodę utlenioną), a znacznie rzadziej stosowane są: woda bromowa, chlorek rtęci, antybiotyki i in. Przed zamoczeniem fragmentów roślin w roztworze czynnika odkażającego wskazane jest umycie materiału pod bieżącą wodą, a w przypadku organów podziemnych, nawet ich kilkugodzinne płukanie. Należy także wyciąć ewentualne tkanki zamierające, dobierając do odkażania materiał możliwie najzdrowszy. Często odkażanie powierzchniowe zaczyna się od krótkiego (kilkudziesięciosekundowego) moczenia materiału w stężonym alkoholu etylowym (70% lub absolutnym). Ten wstępny etap może unieszkodliwić niektóre drobnoustroje, dodatkowo natomiast ma za zadanie usunąć, z powierzchni roślinnej tkanki, woski, tłuszcze i wszelkie inne hydrofobowe substancje, które mogłyby utrudnić dostęp właściwego czynnika odkażającego. Dla ułatwienia kontaktu roztworu odkażającego z powierzchnią komórek czy tkanek, do roztworu tego dodaje się też często niewielką ilość dowolnego detergentu (środka obniżającego napięcie powierzchniowe roztworu). Należy pamiętać, że z reguły czynnik odkażający działa w pewnym stopniu szkodliwie nie tylko na drobnoustroje, ale i komórki roślinne. Czas działania czynnika odkażającego i jego stężenie trzeba dobrać doświadczalnie, zależnie od gatunku rośliny i rodzaju tkanki (typowe wartości podano w tabeli 5). Niektóre substancje przeciwdrobnoustrojowe mogą być ponadto dodawane do pożywki i w ten sposób przez cały czas chronią kulturę przed zakażeniem. Są to przede wszystkim antybiotyki (nieskuteczne w odniesieniu do grzybów) oraz preparat inhibitora oddechowego pod handlową nazwą PPM (Plant Preservative Mixture), zwalczający zarówno bakterie jak i grzyby. Po odkażaniu powierzchniowym materiał kilkakrotnie płucze się jałową wodą destylowaną, po czym można przystąpić do wycinania właściwych eksplantatów pierwotnych i układania ich na pożywce.

W celu uniknięcia zakażeń drobnoustrojami unoszącymi się w powietrzu wszystkie manipulacje na jałowych materiałach, takie jak przelewanie pożywki, odkażanie materiału biologicznego, wycinanie eksplantatów, czy przeszczepianie hodowli, wykonywane są w tzw. komorze laminarnej (dokładniej - komorze z laminarnym nawiewem powietrza). Komora podczas pracy przemywana jest stale laminarnym (tj. niezaburzonym, równomiernym) strumieniem jałowego powietrza, co uniemożliwia wtargnięcie do jej wnętrza drobnych zanieczyszczeń unoszących się w powietrzu. Powietrze przepływające przez komorę jest jałowe, ponieważ przechodzi przez tzw. filtr absolutny czyli HEPA (ang. high efficiency particulate air filter) tj. filtr o porowatości 0,22 μm. Przepływ powietrza wymuszony jest przez elektryczny wentylator. Powietrze zasysane spoza komory przechodzi najpierw przez filtr wstępnego oczyszczania, po czym tłoczone jest przez filtr absolutny (stanowiący tylną lub górną ściankę wnętrza komory). Przed rozpoczęciem pracy w komorze jej wnętrze odkażane jest przez 20 - 30 minutowe naświetlanie promieniami nadfioletowymi (UV-C, o długości fali około 265 nm), a jednocześnie uruchamiany jest przepływ powietrza, dzięki czemu niektóre mikrozanieczyszczenia zostają po prostu z komory wydmuchane. Później blat komory odkażany jest przez przetarcie 50% alkoholem izopropylowym (albo 70% etanolem). Osoba rozpoczynająca pracę przy komorze laminarnej odkaża również ręce przez przetarcie ich alkoholem. Komora laminarna w znacznym stopniu pozwala na uniknięcie przypadkowych zakażeń, ale praca przy niej wymaga staranności i uwagi. Trzeba pamiętać, że główną barierą dla drobnoustrojów jest słabo wyczuwalny strumień powietrza; łatwo naruszyć tę osłonę wykonując szybkie, gwałtowne ruchy rąk, rozmawiając (zwłaszcza ustami zwróconymi do wnętrza komory), kichając, wkładając głowę do wnętrza komory, ustawiając w poprzek komory wysokie naczynia utrudniające przepływ powietrza. Znakomitym sposobem na "uzyskanie" zakażeń, pomimo stosowania komory laminarnej, jest też przenoszenie rąk nad jałowymi (w założeniach) naczyniami i narzędziami. Pomimo odkażania rąk alkoholem, na ich powierzchni pozostaje sporo drobnoustrojów, które opadając mogą zakażać materiały i narzędzia. Dlatego zanim sięgniemy do wnętrza komory po znajdujące się tam przedmioty, musimy zakryć albo wsunąć w głąb komory wszystkie naczynia i materiały, tak by uniknąć ich zakażania. Przedmiotów jałowych nie dotykamy nigdy palcami, ale wykorzystujemy wysterylizowane szczypczyki (pincety). Co kilka do kilkunastu minut powtarzamy sterylizację metalowych narzędzi.

Tabela 4. Skład wybranych pożywek do roślinnych hodowli in vitro
czynnik odkażającystężenie (%)czas odkażania (min)uwagi
podchloryn sodu0,5 - 2 5 - 30bardzo skuteczny; tworzy zupełnie klarowny roztwór; jego łatwo dostępnym źródłem może być chlorowy wybielacz do bielizny (np. płyn Ače - odpowiednio rozcieńczony!); występujące w nim dodatki zapachowe w żaden sposób nie szkodzą; dla zwiększenia trwałości tego roztworu jest on jednak silnie zalkalizowany; niektórzy badacze zalecają zobojętnienie go kwasem solnym przed użyciem do odkażania (nie wydaje się to jednak konieczne)
podchloryn wapnia9 - 105 - 30bardzo skuteczny, ale trudno rozpuszczalny w wodzie tworzy "mleczko"
chloramina T5 do 30 skuteczna; rozpuszczalna w wodzie, trwalsza niż podchloryny
nadtlenek wodoru10 - 125 - 15skuteczny; często stosowany do odkażania nasion roślin iglastych
woda bromowa1 - 22 - 10 skuteczna
azotan srebra15 - 30dość skuteczne, ale zużyte roztwory są bardzo uciążliwe dla środowiska, dlatego stanowczo nie zalecane
chlorek rtęci0,1 - 12 - 10
antybiotyki4 - 50 mg/l30 - 60bardzo skuteczne w zwalczaniu bakterii; zupełnie nieskuteczne w zwalczaniu większości grzybów


1.4 Fizyczne warunki hodowli


Ostatnia modyfikacja strony: 2008-05-13 19:41