| Start | Informacje | Spis treści | Skomentuj | Słownik | Przydatne adresy | Liczba odwiedzin: 313618 |

1.1 Podstawowe definicje; główne kierunki przemian rozwojowych roślinnych tkanek in vitro

1.2 Pożywki

Wszystkie niezbędne do wzrostu substancje hodowany obiekt pobiera z pożywki (tylko kilka składników może być też, w nieznacznym stopniu, pobierane z atmosfery naczynia hodowlanego). Pożywka może mieć postać wodnego roztworu (płynna) albo galaretki (pożywka stała), otrzymanej dzięki dodaniu czynnika żelującego do roztworu substancji odżywczych. Jako substancje odżywcze pożywka zawiera zwykle następujące składniki (tab.1):

Hodowanemu obiektowi trzeba dostarczyć wszystkich niezbędnych pierwiastków. Uważa się, że roślinom do prawidłowego rozwoju potrzebne jest tylko kilkanaście spośród 90 występujących w przyrodzie pierwiastków. Przyjęło się dzielić je na organogeny (węgiel, wodór i tlen), makroelementy (tworzą powyżej 0,1% suchej masy roślin, a w pożywkach występują zwykle w stężeniu powyżej 0,5 mM) i mikroelementy wymagane w mniejszych ilościach (ich zawartość w roślinach może być ponad 1000x mniejsza niż makroelementów). Oczywiście podane zawartości makro- i mikroelementów odnoszą się do roślin oszczędnie odżywianych (nie przenawożonych). Jeśli rośliny hodowane są w środowisku o wysokiej zawartości np. cynku (lub innych przyswajalnych pierwiastków), to stężenie tego składnika w ich tkankach może wielokrotnie wzrosnąć, mimo to jednak nie będziemy cynku uważać za makroelement. Makroelementami są: N, P, K, Ca, Mg, S. Do mikroelementów natomiast zalicza się zwykle: Fe, Mn, Mo, Cu, Zn, B, Cl. Niektórzy fizjologowie roślin wyróżniają również pierwiastki śladowe, albo korzystne (w odróżnieniu od niezbędnych), zaliczając do nich np. Co, Na, Si, Al, V (zależnie od gatunku rośliny). W praktyce jednak granica pomiędzy mikroelementami, a pierwiastkami śladowymi jest trudno uchwytna i w dalszym opisie pierwiastki z obu grup będziemy nazywać mikroelementami. Makroelementy i mikroelementy z reguły dostarczane są do pożywki w postaci prostych soli mineralnych i pobierane są przez komórki w postaci jonów. Żelazo, ze względu na słabą przyswajalność dla roślin w postaci prostych jonów, zazwyczaj stosowane jest w formie chelatów, tj. soli kompleksowych, w których atom metalu połączony jest kilkoma wiązaniami kompleksowymi (tzw. wiązaniami kleszczowymi) z cząsteczką chelatora. Łatwo przyswajalnymi związkami żelaza są na przykład wersenian żelazowo-sodowy, cytrynian żelaza i winian żelaza. W tabeli 1 wśród składników kilku pożywek podano wersenian sodowy i siarczan żelaza, jednakże roztwory tych dwóch substancji łączy się przed dodaniem ich do pożywki, tak że do pożywki wprowadza się już właściwie produkt ich reakcji, tj. wersenian sodowo-żelazowy (NaFeEDTA). Tabela 1 podaje skład pożywek w bardzo często stosowanym formacie; ściślej jednak mówiąc, zawiera ona nie tyle skład pożywki, co zestaw substancji dodawanych do pożywki podczas jej przyrządzania. Rzeczywisty skład jest znacznie bardziej złożony ze względu na dysocjację soli i wzajemne oddziaływania poszczególnych składników podczas sporządzania pożywki, jej odkażania, przechowywania a także podczas hodowli.

Tabela 1. Skład wybranych pożywek do roślinnych hodowli in vitro
 MSB5WPMWHKnop
mMmg/lmMmg/lmMmg/lmMmg/lmMmg/l
Źródła makroelementów (makropierwiastków)
NH4NO320,61650----4,99400--------
KNO318,81900252500----0,8802,5250
CaCl2 * 2H2O344011500,6596--------
MgSO4 * 7H2O1,537012501,537037371250
KH2PO41,25170----1,25170----1,84250
(NH4)2SO4----1134------------
NaH2PO4 * H2O----1,1150----0,1219----
Ca(NO3)2 * 4H2O--------2,355561,22884,231000
KCl------------0,965----
Na2SO4------------1,4200----
K2SO4--------5,68990--------
Źródła mikroelementów (mikropierwiastków)
 μMmg/lμMmg/lμMmg/lμMmg/lμMmg/l
FeSO4 * 7H2O10027,810027,810027,8----(45)(12,5)
Fe2(SO4)3------------6,32,5--
Na2EDTA * 2H2O10037,310037,310037,3----
KI50,834,50,75----4,50,75
H3BO31006,3503 6,2251,5
MnSO4 * 4H2O10022,3---- 29,4329,86,65
MnSO4 * H2O----6010--------
ZnSO4 * 7H2O308,672 8,69,32,67
Na2MoO4 * 2H2O10,2510,2510,25----
MoO3------------0,0070,0001
CuSO4 * 5H2O0,10,0250,10,02510,250,0040,001
CoSO4 * 6H2O0,10,0250,10,025--------
Składniki organiczne
 μMmg/lμMmg/lμMmg/lμMmg/l 
sacharoza87.60030.00058.40020.00058.40020.00058.40020.000
mio-inozytol555,1100555,1100555,1100-
kwas nikotynowy40,58,1140,540,5
pirydoksyna-HCl2,40,54,912,40,50,50,1
tiamina-HCl0,30,129,610310,30,1
pantotenian-Ca------------ 1
glicyna252----252403
cysteina-HCl------ -1
Odczyn (pH)5,6 - 5,8
agar [g/l]10 (8)888--

Analizę składu różnych pożywek utrudnia fakt, że ten sam pierwiastek może być dostarczany w postaci różnych soli, a ta sama sól może (w niektórych przypadkach) być stosowana w różnym stopniu uwodnienia. W związku z tym porównując pożywki warto rozpatrywać stężenia molowe (lub mM czy μM) poszczególnych składników. Wskazane jest też zestawienie tzw. bilansów jonowych pożywek, podsumowujących stężenia danego jonu niezależnie od tego w formie jakiego związku jest dostarczany (tabela 2).

Tabela 2. Bilanse jonowe wybranych pożywek do roślinnych kultur in vitro (zachęcamy czytelnika do uzupełnienia tabeli dla pożywek WPM i WH na podstawie danych z tabeli 1; pożywka Knopa - podobnie jak większość pozostałych - stosowana była w wielu wersjach; zwykle nie zawierała Fe, ale czasami dodawano je w formie siarczanu; zaznaczono to - w tej tabeli, podobnie jak w poprzedniej - liczbami w nawiasach)
 MSB5WPMWHKnop
[mM]
NO3-39,425  6,7
NH4+20,61  0
og.azot6026  6,7
PO43- itp.1,21,1  1,84
K+2025  4,31
Ca2+31  4,23
Mg2+1,51  1,01
SO43-1,7312  1,01 (1,055)
 
Fe2+0,10,1  0 (0,045)
I-0,0050,004  0
BO33-0,10,048  0
Mn2+0,10,06  0
Zn2+0,030,07  0
Mo6+0,0010,001  0
Cu2+0,00010,0001  0
Co2+0,00010,0001  0
Cl-62  0

Pożywka MS, opracowana w 1962 r. przez Murashigego i Skooga (czyt. [Muraszigego] i [Skuuga]) zaliczana jest do podłoży bogatych. Charakteryzuje się zwłaszcza znaczną zawartością azotu i to w obu podstawowych postaciach: azotanowej i amonowej. Pierwotnym przeznaczeniem pożywki MS były hodowle tkanek łodygi tytoniu (por. dodatek 2), ale obecnie jest ona wykorzystywana bardzo powszechnie do kultur in vitro bardzo różnych gatunków roślin i różnych ich fragmentów. Stosunkowo bogatą pożywkę stanowi też zestaw B5 Gamborga, opracowany początkowo w celu hodowli kalusów soi, a charakteryzujący się wysoką zawartością jonów azotanowych, a także witamin z grupy B. O wiele uboższy skład ma pożywka Knopa, opracowana z przeznaczeniem do wodnych i hydroponicznych upraw całych roślin, ale znajdująca czasem zastosowanie także do kultur in vitro, zwłaszcza niezbyt wymagających, na przykład do kiełkowania nasion lub zarodników. Również uboga jest pożywka WH opracowana przez White'a i stosowana głównie do hodowli fragmentów korzeni.

Pożywka WPM została opracowana (przez Lloyda i McCowna) w celu hodowli tkanek roślin drzewiastych (skrót pochodzi od ang. Woody Plant Medium). W porównaniu z pożywką MS podłoże WPM charakteryzuje się obniżoną ogólną zawartością soli, a zwłaszcza związków azotu i chloru. Osiągnięto to, zastępując - częściowo - chlorek wapnia azotanem, a azotan potasu (w całości) - siarczanem. W związku z tym pożywka WPM charakteryzuje się też wysoką zawartością siarki.

Witaminy dodawane do pożywek dla roślinnych kultur in vitro, należą przede wszystkim do grupy B. Zwykle są to: tiamina (B1), kwas nikotynowy (B3, PP), kwas pantotenowy B5, pirydoksyna (B6). Do witamin grupy B zalicza się również mio-inozytol (syn. mezo-inozytol), jakkolwiek w odróżnieniu od wszystkich powyższych witamin inozytol nie zawiera grupy aminowej i nie pełni funkcji prekursora żadnego koenzymu (natomiast jest ważnym składnikiem błony komórkowej). Z tych powodów inozytol pod względem biochemicznym trafniej określany bywa jako cyklitol (cykliczny, wielowodorotlenowy alkohol). Znacznie rzadziej od powyższych substancji dodaje się do pożywki witaminę B2 (ryboflawinę), kwas foliowy (witaminę Bc) oraz - nie zaliczany już do grupy B - kwas askorbinowy (czyli witaminę C). Ryboflawina, na świetle, znacznie przyspiesza utlenianie niektórych regulatorów wzrostu z grupy auksyn i czasami bywa właśnie do tego wykorzystywana. Ponieważ w wyniku takiej fotoprzemiany następuje również unieczynnienie samej witaminy B2, pożywki zawierające tę substancję są na świetle stosunkowo nietrwałe. Jako przeciwutleniacz bywa natomiast dodawany do pożywki kwas askorbinowy. Tę samą funkcję może spełniać aminokwas cysteina. Jeszcze częściej dodaje się do pożywek glicynę oraz kwas glutaminowy lub glutaminę, choć już nie w charakterze przeciwutleniaczy, ale po prostu jako aminokwasy przyspieszające wzrost niektórych obiektów. Prawie zawsze pożywka zawiera też jakiś cukier. Uważa się, że na rośliny dwuliścienne najkorzystniej działa zwykle sacharoza (w stężeniu 1-5%), natomiast do hodowli jednoliściennych lepsza może okazać się glukoza (3 - 4%). Dużo rzadziej dodaje się do pożywki fruktozę, maltozę, galaktozę, laktozę lub mannozę. Sporadycznie opisywano tkanki, np. sekwoi i bielma kukurydzy, które mają tak wysoką aktywność amylolityczną, że jako jedyne źródło węglowodanów wystarcza im polisacharyd - skrobia. Cukry pełnią funkcje zarówno substratu do przemian metabolicznych, jak i substancji decydującej o dostępności dla roślin wody z pożywki (tj. o potencjale osmotycznym pożywki). Wskazuje na to fakt, że w hodowlach kalusa tytoniu sacharozę można częściowo zastąpić rafinozą (cukrem nieprzyswajalnym dla tych komórek).

Wprowadzanie do pożywek cukrów, witamin i aminokwasów może trochę dziwić, bo wiadomo, że w naturalnych warunkach rośliny zadowalają się pobieranymi ze środowiska prostymi związkami mineralnymi. Trzeba jednak pamiętać, że nie wszystkie komórki roślinne przeprowadzają fotosyntezę i są samożywne. Poza tym w warunkach kultur in vitro wydajność fotosyntezy jest dodatkowo ograniczana szybkim wyczerpywaniem się dwutlenku węgla w dość szczelnie zamkniętym naczyniu hodowlanym (szczelne zamknięcie ma chronić hodowany obiekt przed zakażeniami i wysychaniem). Dostarczając hodowanym obiektom organicznych półproduktów, jakimi są cukry czy aminokwasy, możemy uzyskać zwiększenie częstości podziałów i przyspieszenie wzrostu. Z drugiej jednak strony właśnie z powodu dodawania do pożywki składników organicznych konieczne staje się prowadzenie wszystkich manipulacji w warunkach jałowości, ponieważ substancje te bardzo pobudzają rozwój drobnoustrojów. Utrudnia to trochę pracę i podnosi koszty, stąd podejmuje się czasem próby zakładania hodowli w pełni samożywnych, na ubogich, mineralnych pożywkach.

Bardzo charakterystycznymi składnikami pożywek, silnie wpływającymi na wynik hodowli są substancje zwane regulatorami wzrostu, albo fitohormonami. Ta druga nazwa sugeruje oczywiście, że chodzi o roślinne substancje, które pełnią funkcje podobne do zwierzęcych hormonów. W przeciwieństwie jednak do hormonów zwierzęcych, fitohormony często wytwarzane są nie w ściśle określonej tkance, ale w różnych tkankach. Często wyraźnie działają na tę tkankę w której są wytwarzane, podczas gdy hormony zwierzęce z reguły działają w tkankach innych od tych w których zostały wytworzone. Fitohormony mają niewielką swoistość działania - dają szeroki zakres efektów, np. auksyny m. in. pobudzają wydłużanie i podziały komórek, tworzenie tkanek przewodzących, tworzenie korzeni przybyszowych, wzrost owoców, hamują rozrost kątowych merystemów, przerywają spoczynek pąków, wpływają na determinację płci kwiatów, kontrolują starzenie się liści. Z powodu tych różnic między fitohormonami, a hormonami zwierzęcymi, termin regulatory wzrostu (i rozwoju) uważa się za nieco bardziej poprawny (lecz niezbyt poręczny).

Auksyny i cytokininy są najczęściej wykorzystywanymi do hodowli in vitro fitohormonami. Nieco rzadziej wykorzystuje się gibereliny, a także kwas abscysynowy. Sporadycznie dodawane są do pożywki jeszcze inne regulatory wzrostu (tab. 3c).

Auksyny występujące naturalnie w tkankach roślinnych (endogenne) są pochodnymi tryptofanu i zawierają dwupierścieniowy układ indolu. Ich przykładami są. kwas indolilo-3-octowy (IAA) i kwas indolilo-3-masłowy (IBA). Powyższe substancje są też łatwo dostępne w handlu i często dodaje się je do pożywek. Poza indolowymi auksynami w skład pożywek mogą wchodzić także ich syntetyczne analogi, w których indol zastąpiony jest innym układem pierścieniowym. Uważa się, że aby wykazywać działanie typowe dla auksyn substancja musi spełniać następujące warunki: a.) zawiera układ pierścieniowy z co najmniej jednym wiązaniem podwójnym, b.) zawiera łańcuchowy podstawnik sąsiadujący z wiązaniem podwójnym, c.) zawiera grupę karboksylową oddzieloną od układu pierścieniowego jednym lub dwoma atomami węgla. Są to zapewne warunki konieczne lecz nie wystarczające, ponieważ spełniają je również typowe aminokwasy jak tryptofan, fenyloalanina, tyrozyna, a mimo to nie mają aktywności auksynowej. Typowymi syntetycznymi auksynami są np. kwas α-naftylooctowy (NAA), kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy, dicamba (dikamba), picloram (pikloram). Na ogół auksyny syntetyczne mają większą trwałość i wyższą aktywność niż związki będące dokładnymi odpowiednikami auksyn endogennych. Niektóre auksyny syntetyczne (zwłaszcza 2,4-D, picloram, dicamba) bywają stosowane jako herbicydy (środki chwastobójcze; w tym celu używane są jednak w stężeniach kilkadziesiąt tysięcy razy wyższych niż w pożywkach do kultur in vitro - rzędu kilkudziesięciu gramów/l). Wśród substancji modyfikujących działanie auksyn wyróżnia się antyauksyny, tj. związki blokujące receptory auksyn, fitotropiny, tj. substancje blokujące ukierunkowany (polarny, dopodstawowy) transport auksyn, substancje przyspieszające rozpad auksyn i substancje hamujące ten proces (tab. 3). O tym jak różnorodne efekty morfologiczno-fizjologiczne mogą wywoływać auksyny wspominaliśmy już wyżej, szczególną uwagę warto jednak zwrócić na trzy rodzaje reakcji, uważane za najbardziej charakterystyczne dla auksyn:

  1. pobudzanie wydłużania komórek (wzrostu wydłużeniowego)
  2. pobudzanie podziałów komórkowych (we współdziałaniu z cytokininami, a czasami także giberelinami)
  3. uaktywnianie niektórych jądrowych genów.

Działaniu auksyn towarzyszy też zakwaszenie środowiska (wypompowanie protonów z komórek). W niektórych przypadkach samo zakwaszenie środowiska, bez obecności auksyn wywoływało efekty typowe dla działania auksyn.

Typowymi wynikami działania cytokinin są: pobudzenie podziałów komórkowych oraz przeciwdziałanie procesowi starzenia się roślinnych organów. Cytokininy mogą także pobudzać kiełkowanie w ciemności nasion dodatnio fotoblastycznych (tj. wymagających światła do kiełkowania). W pobudzaniu podziałów komórkowych cytokininy współdziałają z auksynami. Pod niektórymi innymi względami są przeciwieństwem auksyn - powstają głównie w korzeniach (auksyny w wierzchołkach pędu), skąd wędrują ksylemem ku górze i pobudzają organogenezę pędową, pobudzają rozwój merystemów kątowych (hamowany przez auksyny), hamują wydłużanie się pędów. Również pod względem chemicznym cytokininy stanowią w pewnym stopniu przeciwieństwo auksyn - o ile, jak już wspominaliśmy, auksyny są kwasami organicznymi, to naturalne cytokininy są pochodnymi adeniny, a więc azotowej zasady. Przykładami takich naturalnie występujących w roślinach cytokinin są zeatyna i N6-izopentenyloadenina (2-iP, IPA). Pochodnymi adeniny, ale mającymi charakter wyłącznie cytokinin egzogennych (sztucznie wprowadzanych) są 6 benzyloaminopuryna (BAP) i kinetyna. Istnieje też grupa substancji o zupełnie innej budowie chemicznej (pochodnych mocznika), ale bardzo podobnym działaniu fizjologicznym, stąd nazywa się je związkami cytokininopodobnymi, albo po prostu mocznikowymi cytokininami. Ich przykładami są tidiazuron (thidiazurone = TDZ) i CPPU. Uwaga! Należy starannie odróżniać cytokininy (fitohormony, substancje niebiałkowe) od zwierzęcych białek zwanych cytokinami!

Wszystkie gibereliny natomiast zawierają złożony, czteropierścieniowy szkielet gibanu. Opisano dotychczas grubo ponad 100 związków tego typu, obejmujących kwas giberelinowy i jego różne pochodne. W praktyce tylko kilka substancji z tej grupy bywa czasami dodawane do pożywek, a najczęściej jest to kwas giberelinowy (GA3). Typowe wyniki działania giberelin, to pobudzenie wydłużania pędów (zwłaszcza u karłowatych mutantów), zahamowanie wzrostu korzeni bocznych, przerwanie spoczynku nasion, pąków i cebul, uaktywnienie enzymów katabolicznych w nasionach, pobudzenie kiełkowania pyłku i wydłużania łagiewek pyłkowych, wywoływanie partenokarpii (powstawania owoców z niezapylonych słupków), pobudzenie kwitnienia w warunkach nieindukcyjnych. Czasami stosuje się też substancje hamujące biosyntezę giberelin, np. paclobutrazol, ancymidol, które powstrzymując wzrost bulw, cebul, czy zarodków, pozwalają na zgromadzenie w nich większej ilości materiałów zapasowych, a także ułatwiają aklimatyzację roślin do niesprzyjających warunków hodowli ex vitro. W tym samym celu mogą być wykorzystywane retardanty, takie jak CCC (chlorek chlorocholiny i AMO 1618).

Przykłady regulatorów wzrostu i rozwoju, które obecnie (jeszcze?) są dużo rzadziej wykorzystywane w kulturach in vitro niż auksyny, cytokininy i gibereliny, podaje tabela 3C.

Warto podkreślić, że wynik działania fitohormonów w pożywce zależy od stanu fizjologicznego umieszczonej na niej tkanki i od występujących w komórkach fitohormonów endogennych. Regulatory wzrostu pobierane są z pożywki, co prowadzi do przejściowego podwyższenia wewnątrzkomórkowego stężenia tych substancji. Ten wzrost jest zwykle krótkotrwały ponieważ istnieją naturalne mechanizmy unieczynniania fitohormonów, częściowo w wyniku rozpadu (np. wspomnianego już utleniania indolowych auksyn), częściowo zaś w wyniku wbudowywania ich w konjugaty - mało aktywne fizjologicznie połączenia z innymi substancjami, np. cukrami. Ocenia się, że zaledwie ok. 1% głównych fitohormonów występuje w komórce w postaci wolnej, większa ich część natomiast tworzy konjugaty.

W niektórych doświadczeniach stosuje się tzw. pulsowe (tj. bardzo krótkotrwałe) działanie badanych składników pożywki. W tym celu eksplantat inkubuje się na pożywce zawierającej badany składnik przez okres zaledwie kilku do kilkudziesięciu godzin, po czym przenosi się na inną pożywkę. Czasami pulsowe oddziaływanie na rośliny jakiegoś składnika pożywki jest wynikiem nie szybkiego pasażu, ale niewielkiej trwałości składnika w pożywce lub tkance. Na przykład jeśli pożywka zawiera witaminę B2 oraz - w niewielkim stężeniu - IAA, a hodowla prowadzona jest na świetle, to auksyna będzie działać pulsowo nawet jeśli eksplantat pozostanie na tej pożywce przez kilka tygodni. Na świetle stosunkowo szybko rozpadają się także niektóre antybiotyki (np. tarcefoksym, tj. cephotaxim).

Tabela 3A. Charakterystyka fitohormonów. Auksyny*
Efekty działaniaPrzykładySubstancje modyfikujące działanie fitohormonu (wpływające na szybkość jego biosyntezy, transportu, rozkładu, lub blokujące receptory)
 Masa mol.Typowy zakres stężeń w pożywce (mg/l)RozpuszczalnikZalecany sposób odkażania
  1. Tworzenie korzeni przybyszowych
  2. Tworzenie zarodków somatycznych
  3. Podziały komórkowe
  4. Tworzenie i wzrost kalusa
  5. Hamowanie wzrostu pąków kątowych
  6. Hamowanie wzrostu korzeni
    IAA
    (kwas indolilo-3-octowy)
    175,20,01 - 3,0etanol / 1N NaOHA/F
    1. Kwas 2,3,4-trójjodobenzoesowy (TIBA) i 1-N-naftyloftalamowy (NPA) działają jako tzw. fitotropiny, tzn. hamują polarny transport auksyn
    2. Kwas p-chlorofenoksyizomasłowy (PCIB) działa jako antyauksyna blokując receptor auksyny
    3. Związki fenolowe (np. kwas ferulowy albo floroglucyna) hamują utlenianie auksyn
    4. Ryboflawina silnie sprzyja fotoutlenianiu IBA i IAA
    IBA (kwas indolilo-3-masłowy)203,20,1 - 10,0etanol / 1N NaOHA/F
    NAA (kwas naftalenooctowy)186,20,1 - 10,01 N NaOHA
    PAA (kwas fenylooctowy)136,20,1 - 50,0etanolA/F
    2,4-D (kw. 2,4- dichlorofenoksyoctowy)221,00,01 - 5,0etanol / DMSO / 1N NaOHA
    CPA (4-CPA, kw. p-chlorofenoksyoctowy)186,60,1 - 5,0etanolA
    picloram (kwas 4-amino-3,5,6- trichloropikolinowy)241,50,01 - 10,0DMSOA
    dicamba (kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy)221,00,01 - 10,0etanol / wodaF
    2,4,5-T (kwas 2,4,5-trichlorofenoksyoctowy)    
    NOA (kwas 2-naftoksyoctowy)    
    * pojęcia najbardziej istotne i godne zapamiętania wyróżniono kolorem

    Tabela 3B.Charakterystyka cytokinin i giberelin
    C y t o k i n i n yEfekty działaniaPrzykładySubstancje modyfikujące działanie fitohormonu (wpływające na szybkość jego biosyntezy, transportu, rozkładu, lub blokujące receptory)
     Masa mol.Typowy zakres stężeń w pożywce (mg/l)RozpuszczalnikZalecany sposób odkażania
    1. powstawanie pędów przybyszowych (wysokie stężenia cytokinin)
    2. hamowanie tworzenia korzeni
    3. podziały komórkowe
    4. powstawanie kalusa i jego wzrost
    5. rozwój pąków kątowych
    6. hamowanie wydłużania pędów
    7. hamowanie starzenia się liści
      zeatyna219,20,01 - 5,01N NaOHA/F Opisano szereg antycytokinin, na przykład lovastatynę, która hamuje biosyntezę cytokinin, a także ich rozpad i działanie; znaczenie tych substancji i skutki ich stosowania są jeszcze słabo poznane
      rybozyd zeatyny351,40,01 - 5,01 N NaOHF
      2iP (N6-izopentenylo-adenina)203,21,0 - 30,01 N NaOHA/F
      izopentenyloadenozyna335,40,01 - 10,0wodaF
      BAP (6-benzyloaminopuryna)225,30,1 - 5,01 N NaOHA/F
      kinetyna (KIN)215,20,1 - 5,01 N NaOHA/F
      TDZ (thidiazurone)220,20,001 - 0,05DMSOA/F
      CPPU (N-(2-chloro-4-pyridyl)-N'fenylomocznik)247,70,001 - 1,0DMSOF
      2hZ (dihydrozeatyna, DZ), Ad (bezwodna adenina), Adh (adenina trójwodna), AdS (siarczan adeniny, bezwodny), AdSh (siarczan adeniny dwuwodny), Ado (adenozyna), mT (meta-topolin)
      G i b e r e l i n y
      1. wydłużanie pędów
      2. przerywanie spoczynku nasion, zrodków somatycznych, pąków wierzchołkowych i cebul
      3. hamowanie powstawania korzeni przybyszowych
      kwas giberelinowy (GA3) 346,40,01 - 5,0etanolA/F Paclobutrazol, ancymidol, CCC, 1-TRIACONTANOL hamują syntezę giberelin i wywołują tym samym:
      1. zahamowanie wydłużania pędów
      2. rozwój korzeni, bulw i cebul
      3. aklimatyzację roślin do niesprzyjających warunków
      giberelina (GA4)332,40,01 - 5,0etanolF
      giberelina (GA7)330,00,01 - 5,0etanolF


      Tabela 3C. Fitohormony rzadziej stosowane do kultur in vitro
      PrzykładyEfekty działaniaSubstancje modyfikujące działanie fitohormonu
      (wpływające na szybkość jego biosyntezy, transportu, rozkładu, lub blokujące receptory)
      etylen
      1. starzenie się liści
      2. dojrzewanie owoców
      3. hamowanie tworzenia organów przybyszowych (w stopniu zależnym od genotypu rośliny i czasu działania regulatora)
      1. ACC (kwas 1-aminocyklopropano-1-karboksylowy) jest prekursorem etylenu (przekształca się w tkankach w etylen)
      2. AVG (aminoetoksyglicyna) hamuje syntezę etylenu.
      3. Jony srebra hamują działanie etylenu. Zazwyczaj stosuje się je w postaci tiosiarczanu srebra (STS).
      kwas abscysynowy (ABA)
      1. dojrzewanie zarodków somatycznych
      2. ułatwianie aklimatyzacji
      3. tworzenie cebul i bulw
      4. wywoływanie spoczynku nasion i in. organów
      Fluridon i paclobutrazol hamują syntezę ABA; fluridon działa poprzez blokowanie wczesnego etapu syntezy karotenoidów, wydaje się jednak, że nie jest toksyczny
      poliaminy:
      putrescyna (PUT)
      spermina
      spermidyna
      1. tworzenie przybyszowych korzeni
      2. tworzenie pędów
      3. tworzenie zarodków somatycznych
      1. DL-α-difluorometyloarginina (DFMA) i α-difluorometyloornityna (DFMO) blokują syntezę putrescyny
      2. Metyloglioksalo-bis-guanylohydrazon (MGBG) i cykloheksyloamina blokują syntezę sperminy i spermidyny
      3. 3-aminoguanidyna (AG) blokuje rozpad putrescyny
      brassinosteroidy
      ergosterol
      brassinolid (BL)
      dolichosteron
      1. pobudzanie wydłużania komórek
      2. pobudzanie histogenezy
      3. wspomaganie adaptacji do stresu (termicznego)
       
      kwas jasmonowy (JA) i jego pochodne
      1. powstawanie bulw i cebul
      2. zawiązywanie się merystemów
       
      metylowy ester (MeJA), kwas dihydrojasmonowy (HJA), kwas tuberonowy, glikozyd kwasu tuberonowego (TAG)
      kwas kukurbitowy (CA)
      kwas salicylowy i jego acetylowana pochodna (aspiryna)
      1. zwiększanie trwałości kwiatów
      2. pobudzanie powstawania zarodków somatycznych
       

      Wszystkie wymienione dotąd składniki pożywek są substancjami o ściśle określonym składzie. Pożywki, które zawierają tylko takie substancje nazywa się syntetycznymi. Czasami wzbogaca się jednak pożywki niejednorodnymi substancjami, które mają bardzo złożony skład chemiczny, nie w pełni znany badaczowi i w niewielkim stopniu przez niego kontrolowany. Dodatkami takimi mogą być: hydrolizat kazeiny, peptony, ekstrakt drożdżowy, mleczko kokosowe, a sporadycznie mleczko kukurydziane, sok pomidorowy itp. Te mieszaniny są zwykle źródłem aminokwasów, witamin lub fitohormonów i gdy tylko to możliwe badacze dążą do zastępowania ich związkami chemicznymi w ściśle określonej postaci i ilości. Hydrolizat kazeiny i ekstrakt drożdżowy mogą pobudzać wzrost eksplantatów, ale bardzo ułatwiają też rozwój drobnoustrojów, stąd czasami dodawane są do pożywki po prostu dla sprawdzenia skuteczności odkażania materiału roślinnego użytego do zapoczątkowania hodowli. Hydrolizat kazeiny wzmacnia działanie cytokinin, zwłaszcza w obecności IAA.

      Czynnikiem żelującym jest najczęściej agar, znacznie rzadziej agaroza, κ-karagen (kappa-karagen; ang. κ-karrageenan) itp. Agar jest substancją polisacharydową budującą ściany komórkowe morskich krasnorostów (Gelidium sp. i Gracilaria sp.), i zawierającą dwie frakcje: niepolarny polimer, zwany agarozą, oraz bardzo zmienną domieszkę polarnych podstawników. Można stosować typowy agar mikrobiologiczny, ale istnieją też w handlu agary przygotowywane specjalnie z myślą o kulturach roślinnych. W takim przypadku wytwórca gwarantuje, że jego produkt nie zawiera żadnych zanieczyszczeń hamujących wzrost roślin. Agary różnych producentów różnią się stopniem czystości i zdolnością żelowania (wytrzymałością mechaniczną galaretki otrzymanej z agaru o danym stężeniu). Przy zakładaniu niektórych, szczególnie wrażliwych hodowli (np. komórek glonu zawłotni) zaleca się przemywanie agaru przed dodaniem go do pożywki, ale takie środki ostrożności stosuje się bardzo rzadko.

      Jakkolwiek agar znalazł bardzo szerokie zastosowanie jako czynnik żelujący, spotyka się też w handlu jego zamienniki. Należy do nich Phytagel (czyt. fajtadżel), polimer otrzymywany z bakterii, a zbudowany z reszt glukozy, ramnozy oraz kwasu glukuronowego. Agargel (czyt. agardżel) jest mieszaniną agaru i Phytagelu. Karagen jest polisacharydem złożonym z podjednostek galaktozowych. Otrzymywany jest ze ścian komórkowych krasnorostów. Gelrite (czyt. dżelrajt) jest polimerem otrzymywanym z bakterii Pseudomonas eloda.

      Czynniki żelujące są zwykle dobierane jako substancje nieprzyswajalne dla roślin, a więc pełniące funkcje mechaniczne oraz osmotycznych regulatorów, ale nie wpływające bezpośrednio na metabolizm roślinnych komórek. Mimo to stężenie czynnika żelującego w pożywce może wywierać silny wpływ na wynik hodowli. Na przykład w hodowlach cienkich skrawków łodygi tytoniu, prowadzonych na poż. z 1% agarem, otrzymywano zawiązki kwiatów, a przy niższych stężeniach agaru - pąki wegetatywne. Czasami w kulturach in vitro dostrzec można zaburzenia związane z gospodarką wodną tkanek i dostępnością wody w pożywce. Typowym objawem takich zaburzeń jest nadmierne uwodnienie tkanek i związany z tym przejrzysty, szklisty wygląd (zaburzenia te nazywa się właśnie szklistością lub witryfikacją). Prawdopodobnie wynikiem nieprawidłowej gospodarki wodnej roślin jest obserwowane czasami zamieranie wierzchołków pędów. Rozwiązaniem takich problemów może być zmiana stężenia lub rodzaju środka żelującego, a także zapewnienie roślinom lepszej wymiany gazowej (np. poprzez zastosowanie odpowiednich pokrywek naczyń hodowlanych).

      W przypadku gdy do pożywki nie dodaje się żadnego czynnika żelującego, a hodowany obiekt zanurzony jest w płynnej pożywce, konieczne jest stałe napowietrzanie hodowli, w przeciwnym razie komórki roślinne uległyby zatruciu produktami fermentacji. Najczęściej hodowle na płynnych pożywkach prowadzone są w kolbach stożkowych, a napowietrzanie pożywki uzyskuje się przez szybkie poruszanie kolb na specjalnych wstrząsarkach. Jeśli eksplantat użyty do takiej hodowli stanowi luźne skupisko komórek, np. kalus to wynikiem wstrząsania kultury może być jego rozpadnięcie się na pojedyncze komórki i drobne skupiska komórek. W ten sposób powstają tzw. hodowle zawiesinowe.

      Dobór pożywki jest w dużej mierze sztuką opartą na metodzie prób i błędów. Ze względu na dużą liczbę składników pożywki i wynikającą stąd ogromną liczbę możliwych kombinacji ich stężeń, w większości prac badacze skupiają się na optymalizacji zawartości jednego do kilku składników, dla pozostałych dobierając wstępnie standardowe, niezmienne stężenia. Ponieważ o kierunku procesów rozwojowych przebiegających w kulturach in vitro decydują głównie fitohormony i (w mniejszym stopniu) witaminy, najczęściej optymalizuje się zawartość tych właśnie składników, natomiast dobór soli mineralnych można zwykle ograniczyć do porównania kilku "klasycznych" zestawów, np. składniki mineralne MS i B5. Porównując działanie kilku, np. czterech, stężeń wybranej auksyny i takiej samej liczby stężeń cytokininy (a więc w podanym przykładzie analizując działanie 16 wariantów pożywki) można wstępnie dobrać optymalny zestaw fitohormonów (warto potem powtórzyć doświadczenie dla innego rodzaju auksyny i cytokininy). Po znalezieniu zadowalającej kombinacji fitohormonów, można sprawdzić, czy dobrana wstępnie pożywka ma najodpowiedniejszy potencjał osmotyczny. W tym celu porównuje się hodowle na pożywkach zawierających zoptymalizowany zestaw fitohormonów i (ewentualnie) witamin, natomiast składniki mineralne w standardowym stężeniu, albo rozcieńczone 2 do 4-krotnie. Warto w końcu porównać także działanie kilku stężeń sacharozy (np. 1 - 6%) i ewentualnie innych cukrów.

      Bardziej systematyczne podejście do optymalizacji składu pożywki stanowi system DeFossarda. Badacz ten zaproponował po 3 zestawy składników mineralnych, auksyn, cytokinin i innych substancji organicznych (zestaw bogaty, średni i ubogi). Każdy z nich łączy się z wszystkimi możliwymi kombinacjami pozostałych zestawów, uzyskując w ten sposób 3x3x3x3 = 81 pożywek do przeanalizowania. Po wybraniu najodpowiedniejszej, można rozważyć dalsze próby optymalizacji jednego do kilku składników uznanych za najważniejsze dla osiągnięcia założonego celu hodowli.

      1.3 Odkażanie


      Ostatnia modyfikacja strony: 2008-05-13 19:41